周緒正 藺紅玲 李 冰 牛建榮 魏小娟 李金善李劍勇 楊亞軍 劉希望 張繼瑜*

1.國家肉牛牦牛產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系疾病控制功能研究室，蘭州 730050；

2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州畜牧與獸藥研究所農(nóng)業(yè)部獸用藥物創(chuàng)制重點實驗室/甘肅省新獸藥工程重點實驗室，蘭州 730050

在動物檢疫及監(jiān)督的日常工作中，常會遇到一些用感官難以確診或定性的染疫動物或產(chǎn)品，對于這些動物或產(chǎn)品，需要通過實驗室檢查才能作出診斷。而一些獸醫(yī)基層單位，因技術(shù)人員知識結(jié)構(gòu)的差異，往往不知道應(yīng)該如何正確操作，也不懂如何自我保護。本文從病料采集前的準備、采集注意事項、常見動物病料的采集方法、病料的固定和保存、病料的送檢以及工作人員的安全防護6個方面進行系統(tǒng)闡述，供各試驗站基地、基層單位在實際工作中參考，為實現(xiàn)科學(xué)、健康、安全養(yǎng)殖保駕護航。

1 病料采集前的準備

首先應(yīng)做好采樣計劃，如要采集足夠量的病料，還要準備采集后用具等清洗、消毒用的消毒液及容器等用品。采集病料所用的刀、剪、鑷子等用具需煮沸30min；使用前用酒精擦拭、火焰消毒；裝載的器皿經(jīng)121℃高壓30min或160℃干烤2h；準備一次性針頭和注射器或真空采血管；采集一種病料，使用一套器械與容器，配制一定量的固定液和保存液。

2 采集注意事項

2.1 細菌性病料的采集

當懷疑動物或其產(chǎn)品為細菌感染時，為確定病菌種類，合理地采集細菌含量最多的病料是做好檢驗定性的第一步。對于活的病畜禽，應(yīng)注意采集其血液、口鼻分泌物、乳汁、膿汁或局部腫脹滲出液、體腔液、尿液、生殖道分泌物和糞便等。對死亡動物采集病料時，應(yīng)剝?nèi)テつw，打開胸腹腔，以無菌操作采集病料。采集病料的種類應(yīng)根據(jù)生前發(fā)病情況或所作的初步診斷有選擇地采集含菌量相應(yīng)最多的臟器或內(nèi)容物。

2.2 病毒性病料的采集

當初步診斷為病毒感染時，若需從動物活體上采集病料，必須在發(fā)病初期、急性期或發(fā)熱期采集；否則，病毒會很快在血液中消失，組織內(nèi)病毒的含量也會因抗體的產(chǎn)生而迅速下降。若從死亡動物尸體上采集病料，其方法與細菌性疫病病料的采集方法基本相同。但無論是從活體還是死尸上采集病料，都既要避免污染，又要防止病毒被滅活。

2.3 死因不明動物病料的采集

對無法作出初步診斷的死因不明動物采集病料應(yīng)盡量全面系統(tǒng)，或根據(jù)癥狀和病理變化有所側(cè)重。有敗血癥病理變化時，應(yīng)采集血、淋巴結(jié)、心、脾、肝等；有明顯神經(jīng)癥狀者，應(yīng)采集腦、脊髓；有黃疸、貧血癥狀者，可采集肝、脾等。

2.4 采集過程中的注意事項

采樣所用刀、剪要銳利，切割要迅速準確，且忌拉鋸式切割，并要防止擠壓病料而造成人為變化；采集的組織標本應(yīng)包含病變和其周圍較正常的組織，包含器官的重要組成部分，如腎應(yīng)有皮質(zhì)、髓質(zhì)、腎盂等，肝、脾、肺應(yīng)含有包膜；病料的大小應(yīng)適宜，以利于及時而徹底地固定；死后要立即采集病料，夏季不能超過4h，若拖延過久，則組織可能發(fā)生變性、腐敗，影響檢驗結(jié)果。當懷疑為炭疽時應(yīng)禁止剖檢，可在頸靜脈處切開皮膚，抽取血液作血片數(shù)張，立即送檢；排除炭疽后，方可剖檢取材。除病理組織學(xué)檢驗病料及胃腸內(nèi)容物外，其他病料應(yīng)無菌采集；器械及容器應(yīng)事先滅菌；當采集活體病料時，如有多數(shù)動物發(fā)病，取材時應(yīng)選擇癥狀和病變典型的病例，最好選擇未經(jīng)抗菌素治療的病例。

3 常見動物病料的采集方法

3.1 血液的采集

1）部位。牛、羊常在頸靜脈采血，豬在耳靜脈（較大的豬）或前腔靜脈（較小的豬）采血，禽從翅靜脈采血，兔從耳靜脈或頸靜脈采血。

2）操作。采血時，先將采血部位清洗干凈，用75%的酒精消毒，待干燥后采血。對牛、羊、豬和兔采血，一般用一次性采血器或注射器，吸出后放試管內(nèi)；或直接用針頭（一般用三棱針）穿刺靜脈后，將血液滴到直徑為3～4mm（可用人用的一次性輸液管）塑料管內(nèi)（長度一般為5cm），將口封好，豎立存放；也可用一次性真空采血管采血。

3）保存。如需要全血樣品，在采血前應(yīng)直接向采血管中加入抗凝劑，如EDTA、肝素等，最好加入肝素作為抗凝劑，采血后充分搖勻；如需用血清樣品，則不需加抗凝劑，在室溫下（不能暴曬）靜置，待血清析出，經(jīng)離心機離心分離出血清，分裝。全血和血清若要長時間保存，則可置冰箱冷凍層（保存時間視冰箱的溫度），但不可反復(fù)凍融；如短時間保存，可以冷藏。

3.2 組織的采集

實質(zhì)性組織，如肝臟、肺臟、脾臟、心臟、腎臟、淋巴結(jié)等，一般最好采集整個臟器。但是考慮到病料的固定和檢驗的目的性，用于微生物學(xué)檢驗的內(nèi)臟組織塊不必太大，有1～2cm見方即可（如有少量污染或不能保證無污染，組織塊取大些，切割后用），將采集好的樣品置于已經(jīng)消毒的容器內(nèi)；若用于病理組織學(xué)檢查，則要采集病灶及臨近正常組織，并存放于10%福爾馬林溶液中固定（如作冷凍切片用，應(yīng)將組織塊置于冷藏容器中，并盡快送實驗室檢驗）。采集動物的內(nèi)臟組織時，如是已死亡的動物應(yīng)盡快采集，夏天不應(yīng)超過2h，冬天不超過6h（還要視具體溫度而定）；采集的動物病料必須新鮮，盡可能減少污染。

3.3 尿液的采集

在動物排尿時，用一次性消毒塑料杯接取。

3.4 陰道分泌物的采集

1）棉拭子法。將消毒棉拭子插入動物陰道內(nèi)，然后在陰道內(nèi)輕輕轉(zhuǎn)動幾下后取出，即可進行涂片鏡檢。對體型較大的動物，也可先按摩或刺激其陰部，而后再采集其陰道液。

2）刮取法。用光滑的玻璃小勺或牛角制的小刮片慢慢插入陰道內(nèi)，在陰道壁輕輕刮取一點陰道分泌物，進行涂片鏡檢。

3.5 呼吸道分泌物的采集

用滅菌的棉拭子采集鼻腔、咽喉內(nèi)的分泌物，蘸取后立即放入特定的保存液中（如滅菌肉湯、磷酸相加緩沖液、Hanks液等），每個棉拭子需保存液5mL。

3.6 皮膚的采集

用鋒利的外科刀刮取病變部皮膚結(jié)痂、皮屑及毛或刮取病變與健康部位交界處的皮膚組織放容器中送檢。

3.7 唾液的采集

1）直接抽取法。動物口腔或唾液腺導(dǎo)管抽吸唾液，此法非常簡單，但從口腔抽吸唾液會有雜質(zhì)混入。

2）制造腮腺瘺法。要用外科手術(shù)方法將腮腺導(dǎo)管開口移向體外，即以腮腺導(dǎo)管為中心，切成一直徑2～3cm的圓形黏膜片，將此黏膜片與周圍組織分開，穿過皮膚切口引到頰外，將帶有導(dǎo)管開口的黏膜片與周圍的皮膚縫合，腮腺分泌的唾液就流出頰外，這種方法可以收集到較純凈的唾液。

3.8 胃液的采集

一般采用直接收集胃液法，先將動物麻醉，將胃管經(jīng)口插入胃內(nèi)，在胃管的出口連吸耳球或注射器，抽吸使胃管內(nèi)形成負壓，胃液靠大氣壓順胃管流出，此法適用于牛、狗等大型動物；或者用pH7.5、35℃左右的生理鹽水灌胃，來回抽插胃管，收集流出液，進行分析。

3.9 腸內(nèi)容物的采集

選病變明顯的腸道，用吸管扎穿從中吸取內(nèi)容物，放入30%甘油鹽水緩沖液保存送檢；或?qū)⒁欢斡袃?nèi)容物的腸管兩端扎緊，剪下送檢；另外，還可先燒灼腸漿膜，然后自該處穿破腸壁，用吸管或棉花球采取內(nèi)容物檢查，或裝在消毒的廣口瓶中送檢。懷疑為中毒的動物，可采集殘余飼料、嘔吐物、胃內(nèi)容物、糞便和血液等。

3.10 胰液和膽汁的采集

通過對胰總管和膽總管的插管而獲得胰液或膽汁；或者通過外科手術(shù)的方法在緊靠腸壁處切開胰管，結(jié)扎固定并與導(dǎo)管相連，即可見無色的胰液流入導(dǎo)管，采集1～2mL即可。

3.11 流產(chǎn)胎兒的采集

將整個胎兒放塑料袋中送檢。

3.12 腦組織的采集

開顱后取出大腦和小腦，縱切成兩半，一半放入50%甘油生理鹽水瓶中供微生物檢驗用，另一半放入10%的戊二醛溶液內(nèi)供組織學(xué)檢查和電鏡檢查用。

3.13 乳汁的采集

乳房和乳房附近的毛以及術(shù)者的手，均需用消毒液洗凈消毒；將最初的幾股乳汁棄去，然后采取乳汁10～20mL于滅菌容器中。

3.14 寄生蟲病料的采集

1）蠕蟲的采集。蠕蟲卵：用漂浮法或沉淀法從糞便中收集或?qū)⒒钕x置生理鹽水中，讓其產(chǎn)卵后收集，放入加熱到75～80℃的巴氏液（40%甲醛溶液30mL，氯化鈉75g，水1000mL）中保存；也可用含有40%甲醛溶液10mL、95%乙醇30mL、甘油40mL、蒸餾水56mL的混合液保存。大型蠕蟲（如蛔蟲）：用彎頭針、毛筆將蟲體收集在生理鹽水中，洗除蟲體上的糞便、黏液，然后保存于70%乙醇或4%甲醛中（固定液加熱到70℃左右，再投入蟲體，使蟲體在熱固定液中伸直而固定）。絳蟲：如頭節(jié)還吸附于腸壁上，為了保證蟲體的完整，切勿用力猛拉，而應(yīng)將附著有蟲體的腸段剪下，連同蟲體浸入生理鹽水中5～6h后，頭節(jié)會自行脫落，體節(jié)也自行伸直。細小蠕蟲（如線蟲）：用分離針等小心從胃腸內(nèi)容物中挑出，放入盛有生理鹽水的小試管內(nèi)，塞緊，充分振蕩，將污物洗凈，然后放入煮沸的5%甘油酒精中，使蟲體伸展保存。

2）蜘蛛、昆蟲的采集?？蓮膭游矬w表或外界環(huán)境中采集。保存蜘蛛類（蜱、螨等）可將其投入開水中片刻，然后保存于70%乙醇內(nèi)（最好加入5%的甘油）。細小昆蟲（如螨和虱蠓等）個體較小，常需刮取皮屑，可直接用70%酒精保存。

3）原蟲的采集。血液內(nèi)原蟲可制成血片用甲醇固定，各片間用硬紙片隔開，用線扎緊；也可采用抗凝血迅速送檢。組織內(nèi)原蟲一般在死后剖檢時，取一小塊組織，做成抹片或組織切片送檢。糞便內(nèi)原蟲（球蟲），一般情況下采集新排出的糞便，按蠕蟲蟲卵收集方法進行卵囊收集。保存卵囊是保存球蟲最常用的方法，在收集到的卵囊中加入2.5%重鉻酸鉀，置室溫中待其孢子形成，孢子形成后的卵囊可在5～20℃的常溫下保存1a。

4 病料的固定和保存

實質(zhì)性器官的病料存放在消毒過的容器內(nèi)。若用于病理組織學(xué)檢查，存放于10%福爾馬林溶液或10%的戊二醛溶液中（如作冷凍切片用，應(yīng)將組織塊放在冷藏容器中，并盡快送實驗室檢驗）；短時間內(nèi)不能送到的病料，上面加滅菌石蠟油2～3cm，用蠟封固，置于裝有冰塊的冰瓶中迅速送檢（沒有冰塊時，可在冰瓶中加冷水，并加入等量硫酸銨，可使水溫冷至零下，將裝病料的小瓶浸入此液中送檢）；夏天在運輸時間長時，要勤換固定液。亦可將病料浸入保存液中，供微生物學(xué)檢查的液體病料，需包扎牢靠，以防止外溢污染、變質(zhì)；供血清學(xué)檢查的血清裝入滅菌小瓶內(nèi)。細菌性病料可用飽和鹽水或30%甘油緩沖液，病毒性病料可浸于50%甘油緩沖液中。進行微生物學(xué)檢驗的病料，若病料不能立即送檢，最佳的保存方法應(yīng)為冷凍或冷藏。

5 病料的送檢

要求送檢人員應(yīng)對動物的整個發(fā)病情況十分了解或有詳實的記錄，最好是現(xiàn)場技術(shù)人員親自送檢，以便提供畜群發(fā)病過程的全部信息，對實驗室診斷十分重要。禁止送檢死亡過久或腐敗變質(zhì)的病料，這種病料對診斷毫無意義，而且還拖延了診斷時間，對疾病的及時有效控制極為不利。微生物檢驗用病料，盡可能專人送檢；送檢時，除注意冷藏保存外，還需將病料妥為包裝，避免破損散毒。用冰瓶送檢時，裝病料的瓶子不宜過大，并在其外包一層棉花，途中要避免振動、沖撞，以免碰破冰瓶。若系郵寄送檢，應(yīng)將病料于固定液中固定24～48h后取出，用浸有同種固定液的脫脂棉包好，裝在塑料袋中，放在木盒內(nèi)郵寄；郵寄標本同時，應(yīng)附上尸體剖檢記錄等有關(guān)材料一份，填寫送檢動物組織種類、數(shù)量、檢驗?zāi)康?、病料所用固定液種類、送檢時間、送檢單位和送檢人及通信地址。每種病料都要附以標鑒，并復(fù)寫送檢單一式3份，1份存查，2份寄往檢驗單位，檢驗完畢后退回1份。

6 工作人員的安全防護

人畜共患病嚴重影響人類（特別是與畜禽密切接觸者）的健康及生命安全。世界上已發(fā)現(xiàn)的人畜共患病有200多種，經(jīng)常流行、危害嚴重的有30多種，如瘋牛病、炭疽、豬鏈球菌病、結(jié)核病、豬囊尾蚴病、牛囊尾蚴病、旋毛蟲病、弓形蟲病、鉤端螺旋體病、沙門菌病、血吸蟲病、狂犬病、高致病性禽流感、鼠疫等。獸醫(yī)工作人員尤其是病料采集人員由于頻繁接觸患病動物，所以是人畜共患病的高危人群，因此，應(yīng)警惕人畜共患病對自身的感染。鑒于上述原因，工作人員在采集病料時應(yīng)該注意以下幾點：第一，注意飲食衛(wèi)生，禁止食用死亡的動物。第二，如果條件允許，可以接種疫苗。接種疫苗的主要目的是降低感染普通傳染病的幾率。第三，工作人員在采集病料時更應(yīng)注意個人衛(wèi)生，工作時戴口罩、穿工作服（防護服）、戴手套，接觸患畜或其糞便等污染物后要勤洗手，并保持工作環(huán)境中空氣流通。第四，工作人員應(yīng)該對動物糞便作及時處理，注意圈舍的消毒。

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