熊學凱 陳穎鈺 郭愛珍 *

1.華中農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，武漢 430070；3.華中農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室，武漢 430070

牛結(jié)核病主要是由牛分枝桿菌引起的人畜共患的一種慢性消耗性傳染病，OIE將其列為需上報疾病，在我國屬于二類動物疫病。該病以組織器官的結(jié)核結(jié)節(jié)性肉芽腫和干酪樣、鈣化的壞死病灶為特征，導致病牛漸進性消瘦、咳嗽、生產(chǎn)能力下降、衰竭直至死亡。牛結(jié)核病在世界各國均有發(fā)生，在我國仍然是最常見的多發(fā)性疾病之一。目前，全球范圍內(nèi)每年約有5000萬頭牛感染結(jié)核病，造成的直接經(jīng)濟損失達30多億美元[1]。另據(jù)報道，世界上結(jié)核病患者中約有15%是通過飲用了結(jié)核病牛所產(chǎn)的牛奶而患病的。牛結(jié)核病的流行不僅嚴重影響到養(yǎng)牛業(yè)，尤其是奶牛業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，而且由于交叉感染使人類的健康受到威脅。因此，世界各國均采用檢疫和撲殺政策控制牛結(jié)核病，但是牛分枝桿菌宿主廣泛，防控方法單一，凈化相當困難。我國牛結(jié)核病的流行狀況尚不清楚，但總體呈上升和蔓延趨勢，在牛結(jié)核病的綜合防控和凈化方面面臨著巨大挑戰(zhàn)。

1 牛分枝桿菌的病原學特征

牛結(jié)核病主要是由分枝桿菌屬牛分枝桿菌引起，另外還有結(jié)核分枝桿菌和禽分枝桿菌。其中，結(jié)核分枝桿菌主要感染人，也可引起牛結(jié)核病；禽分枝桿菌主要感染家禽，也可感染牛、豬和人[2]。

牛分枝桿菌為棍棒狀，較粗短，不產(chǎn)生芽孢和莢膜，也不能運動，屬于革蘭氏陽性菌，用一般染色法較難著色，常用萋-尼氏抗酸染色法染色。該菌為專性需氧菌，最適生長溫度為37.5℃，最適pH值范圍為5.9～6.9，在培養(yǎng)基上生長非常緩慢。在含有牛血清或雞蛋的固體培養(yǎng)基上3周左右才開始生長，呈粟粒大的圓形細小菌落，稍干燥呈鱗屑狀。

牛分枝桿菌富含類脂和蠟脂，對外界環(huán)境的抵抗力較強，對干燥、濕冷、腐敗的耐受力很強。在干燥的痰液中可存活10個月，在病變組織和塵埃中可存活2～7個月，在水中可存活5個月，在糞便和土壤中可存活6～7個月，在乳中可存活3個月，在污水中可存活11～15個月。對熱很敏感，60℃30min可將其殺死，在直射陽光下數(shù)小時可死亡，在100℃沸水中立即死亡，因此經(jīng)巴氏消毒的乳制品已無危險。無機酸、有機酸、堿性物質(zhì)和季銨鹽類消毒劑對該菌無效，但在5%來蘇兒、3%～5%甲醛液、70%酒精和10%漂白粉溶液中均可被殺死[3]。

2 牛結(jié)核病的流行病學

該病主要侵害牛，特別是奶牛，其次是水牛、黃牛，各年齡的牛均可感染。此外，由于牛分枝桿菌的宿主范圍比較廣泛，幾乎可以感染大部分的溫血脊椎動物，如人、豬、鹿、大象、猴、狒狒、獅子及禽類。

病牛和病人，特別是開放型患者是主要傳染源，其糞尿、乳汁、生殖道分泌物、唾液、鼻液、痰液等均能排放病原菌，污染飼料、食物、飲水、空氣和環(huán)境而散播傳染[4]。家畜和人主要通過呼吸道和消化道感染，吸入被污染的飛沫或媒介是傳播本病的最主要方式，也可以通過交配傳播。犢牛主要是由于吮吸帶病原菌的牛奶而感染，成年牛多因與患病牛、病人直接接觸而感染。

該病多呈散發(fā)或地方性流行，無明顯的季節(jié)性和地區(qū)性。飼養(yǎng)管理不當，如廄舍擁擠、通風不良、潮濕、陽光不足、衛(wèi)生條件差及日糧營養(yǎng)不足、缺乏運動、使役過重等均可誘發(fā)本病。

3 牛結(jié)核病的臨床癥狀

牛結(jié)核病的潛伏期長短不一，一般為10～45d，長者可達數(shù)月乃至數(shù)年，通常呈慢性經(jīng)過。因病變器官不同，癥狀不一，臨床中以肺結(jié)核、乳房結(jié)核及腸結(jié)核較為常見，還可見淋巴結(jié)核、生殖器結(jié)核、腦結(jié)核、胸膜結(jié)核等。

3.1 肺結(jié)核

以長期頑固地干咳為特征，且以清晨最為明顯。病牛初期易疲勞，食欲、反芻無明顯變化，常出現(xiàn)短而干的咳嗽，當病牛起立、運動和吸入冷空氣時易發(fā)咳嗽。隨病情發(fā)展，咳嗽加重、頻繁，并轉(zhuǎn)為濕咳，咳嗽聲音較弱，且咳嗽時表現(xiàn)痛苦，呼吸次數(shù)增加，嚴重時發(fā)生氣短。鼻液呈黏性、膿性，灰黃色，呼出氣有腐臭味。胸部聽診常有啰音和摩擦音，叩診有半濁音或清濁音。病牛逐漸消瘦、貧血，肩前、股前、腹股溝、頜下、咽及頸淋巴結(jié)腫大，縱膈淋巴結(jié)腫大時可壓迫食道，引起慢性瘤胃臌氣。病情惡化時，病牛體溫升高至40℃以上，呈弛張熱或稽留熱，呼吸更加困難，最后可因心力衰竭而死亡。

3.2 乳房結(jié)核

病牛一般是乳房淋巴結(jié)腫大，繼而兩乳患病區(qū)發(fā)生局限性或彌散性硬結(jié)，硬結(jié)無熱無痛，表面凹凸不平。泌乳量逐漸下降，乳汁初期無明顯變化，嚴重時可變得稀薄如水。由于腫塊形成和乳腺萎縮，兩側(cè)乳房變得不對稱，乳頭變形、位置異常，導致泌乳停止。

3.3 腸結(jié)核

病牛呈現(xiàn)前胃弛緩，食欲下降，消化不良，迅速消瘦，全身乏力，頑固性腹瀉，糞便呈稀粥狀，帶有黏液和膿汁。直腸檢查時，腹膜粗糙不光滑，腸系膜淋巴結(jié)腫大。

3.4 淋巴結(jié)核

可見于結(jié)核病的各個病型，常見頜下、咽、頸、肩前、股前及腹股溝等部位，淋巴結(jié)腫大突出于體表，無熱痛。咽后淋巴結(jié)腫大時，壓迫咽喉，呼吸音多粗厲、響亮；肩前和股后淋巴結(jié)腫大時，可引發(fā)前后肢跛行。

3.5 生殖器結(jié)核

病母牛從陰道中流出透明的黃白色黏液，混有血液和干酪樣絮片或膿液；情期紊亂，發(fā)情次數(shù)增加，但不易受孕；妊娠牛易流產(chǎn)。病公牛附睪腫大，發(fā)硬，陰莖前部出現(xiàn)結(jié)節(jié)、糜爛。

3.6 腦結(jié)核

病牛多呈神經(jīng)癥狀，如驚恐不安、興奮、肌肉震顫、站立不穩(wěn)、步態(tài)蹣跚、頭頸僵硬、眼肌麻痹等，病程后期可見痙攣、昏迷、呼吸與心率失常。

4 牛結(jié)核病的病理變化

剖檢可見多種組織器官形成肉芽腫或粟粒樣結(jié)節(jié)，以肺和淋巴結(jié)最為多見。肺部出現(xiàn)針尖至雞蛋大小的黃白色堅硬結(jié)節(jié)，切開時有砂礫感，結(jié)節(jié)中心有干酪樣壞死或鈣化灶，有的軟化、溶解形成空洞。胸膜和腹膜表面形成一些粟粒至豌豆大小、半透明的灰白色、較堅硬的結(jié)節(jié)，形似珍珠狀，又稱為“珍珠病”。腸結(jié)核發(fā)生于小腸或盲腸，腸黏膜可見大小不等的結(jié)核結(jié)節(jié)或局灶性潰瘍，潰瘍周圍呈堤狀，底部堅硬并覆有干酪樣物。乳房結(jié)核多發(fā)生于進行性病例，剖開可見有大小不等病灶，內(nèi)含有干酪樣物質(zhì)，還可見到急性滲出性乳房炎的病理變化。

5 牛結(jié)核病的檢測方法

5.1 傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法

嚴格按照《結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程》，對采取的組織病料或痰液進行一定的處理，將收集到的分枝桿菌接種于酸性羅氏培養(yǎng)基上，約1個月后可見黃色粗糙米粒狀菌落即判定為牛分枝桿菌或結(jié)核分枝桿菌。此種方法主要依賴于分枝桿菌的生物學特性和培養(yǎng)特征，能獲得細菌菌落進行定量，可以檢測到1×102～1×103個菌/mL，實驗成本低廉，但是檢測耗時較長（1～2周或更長），培養(yǎng)過程中容易污染，總體檢出率也高，還需要運用其他方法進一步驗證菌株特異性[5]。

5.2 結(jié)核菌素試驗

結(jié)核菌素試驗（PPD）是目前國內(nèi)外應用最多的牛分枝桿菌檢測方法，也是OIE推薦的牛結(jié)核病診斷方法，具有靈敏、簡單和價廉的特點。結(jié)核菌素是從結(jié)核菌中分離得到的菌體蛋白，并經(jīng)飽和硫酸銨或三氯醋酸粗提與純化制成的診斷制品。如果機體感染過結(jié)核病，免疫B細胞會對結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生記憶，當再次用結(jié)合菌素去刺激機體，機體會產(chǎn)生超敏反應性炎癥，導致皮膚增厚。其結(jié)果判斷標準為：增加4mm為陽性，2～4mm為可疑，2mm以下為陰性。PPD皮試的缺陷有：工作量和勞動強度大，檢測時間間隔較長，測量皮厚時存在人為誤差，結(jié)果判斷主觀性強，同時也存在一定非特異性反應。

5.3 IFN-γ體外釋放檢測法

IFN-γ體外釋放檢測是一種細胞免疫檢測方法，IFN-γ主要是由活化的T淋巴細胞及自然殺傷細胞產(chǎn)生，可以用PPD刺激被檢抗凝全血中的淋巴細胞24h，由于免疫細胞存在記憶性，如果是已致敏的免疫細胞就會產(chǎn)生大量的IFN-γ，通過檢測IFN-γ的數(shù)量變化，來間接檢測機體是否感染了結(jié)核分枝桿菌。此種方法靈敏度與特異性均較高，操作快速簡單，只需要較少的血液樣本[6]，可實現(xiàn)批量檢測。但是IFN-γ的產(chǎn)生依賴于記憶性免疫細胞，本身也缺乏一定特異性，采血后需在24h內(nèi)進行刺激，只能檢測特定時期的感染情況，成本也較高。

5.4 抗體檢測法

由于抗體檢測法快速、簡便，可大批量檢測，便于實現(xiàn)自動化，具有很好的應用前景，目前的抗體檢測法有ELISA與膠體金試紙條2種。

ELISA檢測法通過將結(jié)核分枝桿菌的特異性抗原包被到固相載體上，對血清中的特定抗體進行定性和定量檢測，是一種間接檢測結(jié)核分枝桿菌的方法。此種方法由于ELISA試劑盒的普遍商品化而更加經(jīng)濟實惠，樣本易得，實驗操作也簡單快捷，可以進行輔助性診斷。但是不同蛋白的特異性不一樣，檢測時敏感性和特異性存在一定的差異性。

膠體金試紙條是利用免疫學原理檢測牛結(jié)核抗體的一種簡單快速的方法，建立在膠體金顆粒的特異結(jié)構(gòu)和特性上[7]。當膠體金顆粒上的特異性結(jié)核抗原與血清中的結(jié)核抗體結(jié)合，隨著層析效應與檢測線上能與抗體反應的抗原結(jié)合時，出現(xiàn)一條紅色的陽性檢測線，而當顆粒繼續(xù)移動到達質(zhì)控線，結(jié)核抗原會與預先固定好的相應抗體結(jié)合而控制試紙條的質(zhì)量。此方法也存在一定缺點，如試紙條受各種理化因素影響較大，要用特定的緩沖液稀釋，檢測的靈敏度易受影響等。

5.5 PCR和多重PCR檢測

PCR和多重PCR檢測技術是利用多聚酶鏈式反應直接檢測樣品中的結(jié)核分枝桿菌，相對免疫學的間接檢測方法則更具有檢測意義，已應用于各醫(yī)院的結(jié)核病診斷及各牛場的牛結(jié)核病檢測和流行病學調(diào)查中。當?shù)玫奖粰z樣品，如全血、奶樣、組織、痰液等標本后，進行樣本的初處理，去除脂類和一些雜質(zhì)，然后集菌并加裂解液或直接煮沸裂解，獲得的結(jié)核菌DNA樣本就可以作為PCR的模板。PCR是針對結(jié)核分枝桿菌特異性的基因設計引物，而多重PCR則是針對多個特異基因設計引物，進行多聚酶鏈式反應擴增，得到特異性的目的條帶，從而特異性檢測出結(jié)核分枝桿菌。多重PCR相對PCR而言更方便快捷、經(jīng)濟實惠、工作量小，一次反應可以檢測多個目的基因，但是引物設計要更復雜，對設備和人員的要求也更高[8]。

6 牛結(jié)核病的綜合防控措施

6.1 預防為主，積極研發(fā)新技術

隨著人類對結(jié)核病防控認識的進一步深入，發(fā)現(xiàn)根除動物結(jié)核病其實是根除人類結(jié)核病的必要前提。由于動物飼養(yǎng)量及流動量大幅增加、野生動物的活動及國際貿(mào)易的日益頻繁，牛結(jié)核病的流行率不斷上升，以預防為主的疫苗免疫越來越受關注。目前，結(jié)核疫苗是醫(yī)學領域研究的熱點之一[9]，國內(nèi)外已開展一系列結(jié)核病新型疫苗的研究，而且借鑒人類結(jié)核疫苗的開發(fā)經(jīng)驗，動物疫苗研制的后發(fā)優(yōu)勢將比較明顯。鑒于卡介苗（BCG）的高安全性，已將BCG用于牛結(jié)核病的預防以檢驗對牛和其它野生動物的保護力，同時通過各種途徑來提高BCG原有的保護力和尋找BCG的替代物。

除了結(jié)核疫苗外，需積極研發(fā)、利用新型技術和手段來加強牛結(jié)核病的預防。例如，可將先進的電腦系統(tǒng)利用到整個牛結(jié)核病的防疫體制，利用地理信息系統(tǒng)（GIS）或地球定位系統(tǒng)（GPS）進行牛結(jié)核病流行病學的監(jiān)測與可追溯[10]，能隨時關注全國的檢疫動態(tài)。

6.2 加強檢疫，防止疫病傳入

無結(jié)核病的健康牛群應每年春、秋各進行1次結(jié)核菌素變態(tài)反應檢疫，以便及時發(fā)現(xiàn)病牛，清除傳染源，凈化牛群。在引進牛時，先進行產(chǎn)地檢疫，確認為陰性方可引進，運回后隔離觀察1個月以上再進行檢疫，確認健康后方可混群飼養(yǎng)。

盡量減少牛群接觸病原菌的機會，牛分枝桿菌的主要宿主是牛，但獾、白尾鹿等野生動物宿主也是感染牛的重要傳染源。因此，牛舍內(nèi)不能同時飼養(yǎng)其它牲畜及禽類，防止可能隱匿分枝桿菌。同時，對已嚴重污染的場地實行關閉、停產(chǎn)，防止因消毒不徹底或在原場地生長的各種帶菌動物對牛群造成感染[11]。

6.3 隔離撲殺，凈化污染牛群

對檢出的陽性牛原則上應立即撲殺，也可以隔離飼養(yǎng)，并定期進行檢疫；發(fā)現(xiàn)開放性結(jié)核病病牛時，應立即撲殺，尸體要進行深埋或焚燒等無害化處理。優(yōu)秀的高產(chǎn)奶?；蚍N?；疾?，可用鏈霉素、異煙肼利福平等藥物進行治療。對疑似病牛應隔離飼養(yǎng)，1個月后進行復查，如仍有疑似反應，要繼續(xù)隔離飼養(yǎng)，再經(jīng)25～30d進行復查，如還有疑似反應，可按陽性牛進行處理。

對污染牛群，每年進行4次以上檢疫，檢出的陽性牛及可疑牛要立即分群為陽性牛群與可疑牛群。剔除陽性牛及可疑牛后的牛群，應間隔30～45d檢疫1次，連檢3次均為陰性者，認為是健康牛的可放入假定健康牛群。假定健康牛群為曾經(jīng)檢出結(jié)核陽性牛，且每年檢疫陽性率在3%以下的牛群，需每年進行2次以上定期檢疫。當無陽性牛出現(xiàn)時，再經(jīng)過1.0～1.5a連續(xù)3次檢疫，結(jié)果均為陰性時，可確定為健康畜群[12]。

6.4 堅持消毒，培養(yǎng)健康犢牛

每年定期（2～4次）對整個牛舍及周圍環(huán)境進行全面消毒，消滅傳染源與傳播媒介。飼養(yǎng)場或牛舍進出口處要設置消毒池，內(nèi)置有效消毒劑，如3%～5%來蘇/L溶液或20%石灰乳等，對進出的車輛、飼養(yǎng)人員、獸醫(yī)人員要嚴格消毒。牛舍、運動場每月消毒1次，飼養(yǎng)用具每10d消毒1次；金屬設施、設備可采取火焰、熏蒸等方式消毒，飼料、墊料可采取深埋發(fā)酵處理或焚燒處理；產(chǎn)房每周進行1次大消毒，分娩室在臨產(chǎn)牛生產(chǎn)前及分娩后各進行1次消毒。

病牛專門設置分娩室，分娩前消毒乳房及后軀，所產(chǎn)犢牛立即與母牛隔離，人工喂健康牛的初乳5d，之后喂健康牛乳或消毒乳。犢牛應在6個月隔離飼養(yǎng)中分別于20～30、100～120和160～180d進行3次檢疫，均為陰性反應的牛可轉(zhuǎn)入假定健康牛群；陽性犢牛全部淘汰；可疑犢牛需在30～45d后復檢。

6.5 加強管理，提高防疫意識

飼養(yǎng)管理人員要定期體檢，取得健康證后方可上崗，嚴禁互相串崗，非工作人員不得隨意出入牛場，避免人畜互相傳染。

檢疫部門應加強牛場疫病防治工作的指導和監(jiān)督，建立健全奶牛防疫制度，全面實行奶牛健康證和戶口臺帳管理，所有奶牛都應登記造冊，及時記錄奶牛存欄和調(diào)運狀況。對健康奶牛發(fā)給奶牛結(jié)核病檢疫合格證明，憑證銷售牛奶或轉(zhuǎn)讓健康牛，以保障奶牛業(yè)的健康發(fā)展。同時，定期開展牛結(jié)核病的監(jiān)測、檢疫，督促牛場及時撲殺病牛，不留隱患，指導并監(jiān)督消毒和防疫措施的實施。

6.6 制定有效的防控和凈化計劃

由于宿主范圍廣泛、感染與發(fā)病過程緩慢、潛伏感染普遍、幾乎無現(xiàn)代化的控制手段（無疫苗、無藥物、無快速高通量檢測方法），牛結(jié)核病的控制和根除是一個循序漸進的漫長過程[13]，需要制定有效的防控和凈化計劃，并長期保持信心和熱情。

加強對牛結(jié)核病及野生動物結(jié)核病的流行病學調(diào)查研究，實施高覆蓋率采樣，整合相關調(diào)查結(jié)果，徹底摸清病原流行及分布特點，為牛結(jié)核病的防控和凈化打下堅實的基礎。學習發(fā)達國家控制牛結(jié)核病的重要措施和成功經(jīng)驗，加大牛群流動監(jiān)管力度，減少區(qū)域之間的無序流動現(xiàn)象，建立完整的可追溯體系，實現(xiàn)區(qū)域化管理。同時，健全更新牛結(jié)核病的相應政策法規(guī)，提高公眾對牛結(jié)核病防控意義的認識，各級政府、各級官員、專家、獸醫(yī)防疫人員、養(yǎng)殖業(yè)主和消費者等多方面力量相互配合，為有效控制牛結(jié)核病提供保障。

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