韓瀟瀟 陳穎鈺 郭愛珍 *

1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，武漢 430070；3.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430070

牛支原體是一種能夠引起肉牛和奶牛多種疾病的重要病原體，也是牛呼吸道綜合癥的重要病原體之一。牛支原體除了導(dǎo)致肺炎、乳腺炎外，還可導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎、角膜結(jié)膜炎、耳炎、生殖道炎癥、流產(chǎn)與不孕等多種疾病[1]。在臨床病例中牛支原體引起的疾病沒有典型癥狀，且常常與其他多種致病菌混合感染，與其他疾病難以區(qū)分，所以極易被忽視。自l961年在美國首次分離到支原體以來[2]，全世界大多數(shù)國家都已經(jīng)發(fā)生過牛支原體相關(guān)疾病的疫情；我國在2008年也首次報(bào)道了牛支原體肺炎的疫情，發(fā)病率為50%～100%，病死率高達(dá)10%～50%，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。

1 病原學(xué)

牛支原體屬于柔膜體綱支原體目支原體科支原體屬，是一類缺乏細(xì)胞壁、具有高度形態(tài)多樣性、可通過濾菌器并能在無生命培養(yǎng)基中生長繁殖的最小的原核細(xì)胞型微生物[5]；牛支原體基因組大小為1080kb，G+C含量為27.8%～32.9%，牛支原體和牛無乳支原體基因組非常相似，在16SrRNA上有99%的同源性[1]。

牛支原體一般寄生在黏膜表面，主要寄生于鼻腔，其次在乳腺。牛支原體在環(huán)境中的存活力較其他支原體稍強(qiáng)，如在避免陽光直射條件下可存活數(shù)周，在4℃牛奶和海綿中可存活2個(gè)月；在水中可存活2周以上；在20℃時(shí)，其存活時(shí)間降至1～2周，在37℃時(shí)其存活時(shí)間降為1周；牛支原體在65℃2min、70℃ 1min可滅活；但4～37℃范圍內(nèi)在液體介質(zhì)中可存活59～185d；在其他材料中的存活時(shí)間是：糞 37d，棉 18d，秸稈 13d，木和不銹鋼 1～2d[6]。

2 流行病學(xué)

牛支原體自然感染的潛伏期較難確定。國外有報(bào)道，在健康犢牛群中引入感染牛24h后，就有犢牛從鼻腔中排出牛支原體，但大部分牛在接觸感染牛7d后經(jīng)鼻腔排出牛支原體。有的牛在接觸感染牛2周后發(fā)病[3]。我國牛支原體病的暴發(fā)幾乎都與運(yùn)輸有關(guān)，多數(shù)牛在運(yùn)輸?shù)侥康牡睾?周左右發(fā)病，如在途中遭遇雨淋等不良環(huán)境影響，?？稍谶\(yùn)達(dá)目的地后第2天即發(fā)病。感染牛支原體的?？蓴y帶病原體數(shù)月甚至數(shù)年而成為一個(gè)傳染源。主要傳播途徑是通過飛沫經(jīng)呼吸道傳播，近距離接觸、吮吸乳汁或生殖道接觸等也可傳播牛支原體[7]。

牛支原體通常和其他病原體混合感染。常見的混合感染細(xì)菌有多殺性巴氏桿菌、化膿隱秘桿菌、溶血性曼氏桿菌和昏睡嗜血桿菌。常見的混合感染病毒有牛皰疹病毒l型或牛傳染性鼻氣管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹瀉病毒、牛呼吸道合胞體病毒、牛冠狀病毒和牛呼腸孤病毒等[6]。這些病毒可誘導(dǎo)免疫抑制，促使細(xì)菌性病原增殖并下行至肺，引發(fā)肺炎。

異地運(yùn)輸、飼養(yǎng)方式或環(huán)境條件改變等應(yīng)激因素是牛支原體肺炎的誘發(fā)因素，同時(shí)牛支原體感染對機(jī)體免疫系統(tǒng)造成極大破壞，也進(jìn)一步促進(jìn)繼發(fā)感染或混合感染的病原微生物的致病作用。除細(xì)菌和病毒的混合感染外，血孢子蟲感染可能對牛支原體肺炎的發(fā)生也有促進(jìn)作用[3]。

3 臨床癥狀和病理變化

牛支原體感染牛只后，往往會(huì)引起慢性肺炎癥狀，病程較長，發(fā)病初期體溫升高至42℃左右，病牛精神沉郁、食欲減退、咳嗽、氣喘、清晨、半夜或氣溫轉(zhuǎn)涼時(shí)咳嗽劇烈，有清亮或膿性鼻汁，嚴(yán)重者食欲廢絕，病程稍長時(shí)患牛明顯消瘦，被毛粗亂無光；有的患牛繼發(fā)腹瀉，糞呈水樣或帶血；有的患牛繼發(fā)關(guān)節(jié)炎，表現(xiàn)跛行、關(guān)節(jié)膿腫等癥狀；也有病牛繼發(fā)結(jié)膜炎，眼結(jié)膜潮紅，有大量漿液性或膿性分泌物。嚴(yán)重者出現(xiàn)死亡，犢牛病情相對嚴(yán)重，病死率可達(dá)50%[3，6]。

剖檢病理變化主要集中在胸腔與肺部。肺和胸膜發(fā)生不同程度粘連，有少量積液；心包積水，液體黃色澄清；肺發(fā)生不同程度地病變，可能與病程及機(jī)體抵抗力有關(guān)。輕者可見肺尖葉、心葉及部分膈葉的局部紅色肉變，或同時(shí)有化膿灶散在分布；嚴(yán)重者可見肺部廣泛分布有干酪樣或化膿性壞死灶。病理組織學(xué)觀察可見支氣管肺炎或化膿性壞死性肺炎，或凝固性壞死性肺炎[3，6]。

4 診斷方法

4.1 病原體的分離鑒定

按照無菌操作規(guī)程將小塊組織樣本涂于類胸膜肺炎微生物（PPLO）和適當(dāng)抗生素的固體培養(yǎng)基表面，于體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中，同時(shí)將小塊組織樣本投入到PPLO液體培養(yǎng)基中。2～3d后在光學(xué)顯微鏡下低倍觀察菌落形態(tài)，支原體菌落應(yīng)具有“煎蛋樣”典型特征，液體培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色且透亮[6]。

4.2 基因檢測

牛支原體基因檢測方法主要是PCR方法。由于牛支原體和牛無乳支原體同源性很高，所以僅僅使用PCR檢測16SrRNA的擴(kuò)增片段無法區(qū)分牛支原體和牛無乳支原體，需要使用RT-PCR、雜交探針和解鏈溫度分析等輔助才可以快速靈敏地區(qū)分這2種病原。此外，PCR擴(kuò)增16SrRNA后，再進(jìn)行變性梯度凝膠電泳也可以快速鑒別出這2種病原[8]。根據(jù)牛支原體特異性基因UvrC建立的環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增檢測（LAMP）方法，具有較高的特異性和靈敏性，為牛支原體的快速診斷提供了方法[9]。

4.3 血清學(xué)檢測

牛支原體血清學(xué)檢測方法包括間接血凝試驗(yàn)、生長抑制試驗(yàn)、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等，用處理過的牛支原體全菌蛋白作包被抗原的間接ELISA是當(dāng)今最主要的血清學(xué)檢測方法。在歐洲等國家已有商業(yè)化的ELISA試劑盒出售，其敏感性和實(shí)效性都比傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法好得多，可用該法評價(jià)牛支原體血清抗體陽性率和建立無牛支原體感染牛場[10]。一種針對牛支原體全菌裂解物的單克隆封閉抗體作為目標(biāo)抗原的封閉ELISA方法，在檢測牛支原體血清抗體時(shí)具有高度特異性、敏感性、較少的背景干擾和交叉反應(yīng)[11]。

4.4 免疫組化

免疫組化是一種敏感、特異的鑒定病原的方法，該方法主要優(yōu)點(diǎn)在于可以檢測到支原體抗原在體內(nèi)的分布情況；特別是在其他方法表明牛支原體存在，但病原培養(yǎng)又為陰性時(shí)，免疫組化就顯得更為重要[12]。在干酪樣壞死性支氣管肺炎的組織損傷中，免疫組化結(jié)果表明牛支原體抗原遍布于干酪樣壞死灶處，但是在壞死灶周圍尤其顯著；抗原主要在巨噬細(xì)胞的胞漿內(nèi)，在壞死物質(zhì)中沒有?？乖瑫r(shí)也存在于肺泡和支氣管腔內(nèi)的巨噬細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞和中性粒細(xì)胞內(nèi)[13]。

5 疫苗研究進(jìn)展

雖然牛支原體是引起犢牛肺炎、乳腺炎和關(guān)節(jié)炎的主要致病菌，但目前還沒有特別有效的牛支原體疫苗[1]。由于牛支原體對抗生素的敏感性較差，所以使用疫苗預(yù)防將會(huì)是一種較為理想的控制方法。但目前除美國外，幾乎沒有商業(yè)化疫苗用于牛支原體病的預(yù)防，一些商業(yè)化的疫苗（包括2株預(yù)防牛肺炎的疫苗Pulmo-GuardTMMpB和Myco-BacTM B，1株預(yù)防乳腺炎的疫苗 MycomuneTM）雖已在美國應(yīng)用，但沒有任何文獻(xiàn)報(bào)道可以說明這些疫苗是否有效。在歐洲，一種包括牛支原體在內(nèi)的四價(jià)滅活苗可以提供一定的預(yù)防效果。另一種有高免疫源性的皂苷滅活疫苗可以對攻毒后動(dòng)物提供較高的保護(hù)力，免疫后的牛臨床癥狀較輕微，體溫、肺部病變、體重消長等指標(biāo)與未免疫牛有較顯著差異，且免疫牛對支原體在體內(nèi)的擴(kuò)散有一定的抑制作用[14]。所以就目前看來，牛支原體還缺乏一種真正的商業(yè)化疫苗來防止該病的發(fā)生。

6 綜合防制措施

6.1 治療

“早診斷，早治療”是有效控制本病的基本原則。有牛場證實(shí)在牛群引進(jìn)后立即進(jìn)行全群治療，可明顯降低發(fā)病率和死亡率。早期應(yīng)用抗生素治療牛支原體病有一定效果，但應(yīng)保持足夠用藥量和用藥療程[15]。牛支原體無細(xì)胞壁，對作用于細(xì)菌細(xì)胞壁的β-內(nèi)酰胺酶類抗菌藥物（如青霉素和頭孢類藥物）不敏感，因此應(yīng)選用作用于細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的相關(guān)藥物。另外，牛為反芻動(dòng)物，藥物內(nèi)服效果相對較差。實(shí)驗(yàn)室藥敏試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)牛支原體的敏感抗生素有四環(huán)素類、替米考星或壯觀霉素等。牛支原體對喹諾酮類藥物（如環(huán)丙沙星、泰樂菌素類藥物）也敏感。但臨床用藥經(jīng)常與實(shí)驗(yàn)室結(jié)果出現(xiàn)差異，這可能與牛支原體耐藥性、混合感染、病程等多種因素有關(guān)[3]。

6.2 預(yù)防

1）加強(qiáng)牛群引進(jìn)管理和檢疫。不從疫區(qū)或發(fā)病區(qū)引進(jìn)牛，盡量減少遠(yuǎn)距離運(yùn)輸，減少交易環(huán)節(jié)。牛群引進(jìn)前應(yīng)做好牛支原體病、牛結(jié)核、泰勒蟲病等病的檢疫檢測，防止引進(jìn)病?；蛱幱跐摲腥酒诘膸Ь！Ｔ诋a(chǎn)地完成預(yù)防接種，防止引進(jìn)病牛和帶菌牛。牛群引進(jìn)后應(yīng)進(jìn)行隔離觀察，確保無病后方可與健康?；烊海ㄆ趯εＨ哼M(jìn)行血清學(xué)檢查以便及時(shí)掌握本病在牛群中的流行情況。在有條件的情況下，進(jìn)行“自繁自養(yǎng)”，這是控制疾病流行的較好方法。育肥牛群采用全進(jìn)全出制度，在空欄期要對牛舍進(jìn)行徹底消毒。

2）加強(qiáng)牛只的飼養(yǎng)管理，減少環(huán)境應(yīng)激。保持牛舍通風(fēng)良好、清潔、干燥。牛群密度適當(dāng)，避免過度擁擠。不同年齡及不同來源的牛應(yīng)分開飼養(yǎng)。適當(dāng)補(bǔ)充精料與維生素及礦物元素，保證日糧的全價(jià)營養(yǎng)。確保犢牛至少在運(yùn)輸前30d斷奶，并已適應(yīng)粗飼料與精飼料喂養(yǎng)。定期消毒牛舍，及時(shí)發(fā)現(xiàn)與隔離病牛，盡早診斷與治療。

7 結(jié) 語

牛支原體病是呈世界性分布的重要傳染病，尤其在養(yǎng)牛業(yè)發(fā)達(dá)的國家，這種疾病的發(fā)生更為嚴(yán)重，給養(yǎng)牛業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。隨著我國牛養(yǎng)殖量的增加，飼養(yǎng)方式向規(guī)模化和集約化等現(xiàn)代養(yǎng)殖模式轉(zhuǎn)變，我國養(yǎng)牛業(yè)受該病的威脅也越來越大。現(xiàn)階段國內(nèi)外對牛支原體研究不深入也不透徹，因此需要投入更多的人力、物力深入研究牛支原體病的免疫和致病機(jī)制，開發(fā)有效的診斷試劑及疫苗，有效防控牛支原體病，保障養(yǎng)牛業(yè)健康、快速發(fā)展。

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