林燕，劉華緒，張福仁

（山東省皮膚病性病防治研究所，濟南250022）

反射式共聚焦激光掃描顯微鏡（Reflectance confocal miscroscopy，RCM）是20世紀80年代發(fā)展起來的一種先進的細胞生物學分析儀器，是近代生物醫(yī)學圖像分析儀器最重要的發(fā)展之一，本文簡要介紹其結(jié)構原理并綜述近年來對其在皮膚科應用的研究進展。

1 概述

RCM是美國學者在傳統(tǒng)的共聚焦激光掃描顯微鏡（Confocal laser scanning miscroscopy，CLSM）基礎上改進，從而實現(xiàn)了皮膚的在體成像。RCM和傳統(tǒng)的CLSM一樣，也是采用830 nm的半導體激光點光源代替?zhèn)鹘y(tǒng)光鏡的場光源，是探測點與照明點相對于物鏡焦平面是共軛的。只有焦平面上的點同時聚焦于探測點和照明點，焦平面以外的點不會在探測點處成像，即共聚焦，可有效抑制同一焦平面上非測量點的雜散熒光及來自樣品中非焦平面的熒光，從而獲得普通光鏡無法達到的分辨力。同時，RCM系統(tǒng)配置的在體掃描裝置，可以精確控制逐層對皮膚表皮和真皮淺層進行成像，RCM利用不同層面不同組織細胞結(jié)構對光的反射和折射的差異實現(xiàn)的灰度圖像。RCM可以實現(xiàn)同一個深度（XY軸）和同一點不同深度（Z軸）的成像，相當于在皮膚活體生理狀態(tài)下進行無損傷的系列“光學切片”。因而，RCM在中國又被形象地稱為“皮膚CT”[1]。

2 RCM在皮膚科的應用

隨著技術的進步，RCM可以實現(xiàn) 300～500 μm深度的皮膚在體成像。其具有的和組織學切片相媲美的高分辨率（橫向分辨率和側(cè)向分辨率在1 μm）、無創(chuàng)、動態(tài)成像、數(shù)據(jù)易于存儲等優(yōu)點，在皮膚科臨床得到了較為深入的推廣應用。

2.1 色素性皮膚病 黑素為人體皮膚內(nèi)最強的自身對照，因此皮膚內(nèi)黑素異常引起的色素性疾病是RCM檢查的最佳適應證，并有助于探討其發(fā)病機制[2]。Rajadhyaksha等[3]在1995年首次提出RCM可以用于色素相關的皮膚病的診斷。

2.1.1 色素減少性皮膚病 白癜風是皮膚科常見的色素脫失性疾病，早期往往與其他色素減退性疾病如貧血痣，無色素痣等難以鑒別，Ardigo等[4]在2007年對16例白癜風患者的白斑區(qū)及周圍正常皮膚區(qū)進行成像，并觀察部分病人NB-UVB治療后的反應，發(fā)現(xiàn)如下特點：①白斑區(qū)真表皮交界處的高折光的真皮乳頭環(huán)缺失；②白斑周圍外觀正常皮膚可呈現(xiàn)程度不同的折光異常，如半環(huán)狀態(tài)；③NBUVB治療后治療區(qū)可見活躍的高折光的樹枝狀細胞。劉華緒等[5]對包括白癜風、貧血痣、無色素痣在內(nèi)的常見色素減退性皮膚病的RCM圖像特點進行了分析，發(fā)現(xiàn)無色素痣RCM下呈現(xiàn)程度不等的色素減少，但不會出現(xiàn)色素完全缺失情況，而貧血痣相對來說色素減退情況較輕。

2.1.2 色素增加性皮膚病 Liu等[6]對210例黃褐斑皮損進行分析，并對其中的10例同時進行病理學分析，兩者的結(jié)果基本一致，大多數(shù)皮損表現(xiàn)為表皮內(nèi)黑素顆粒的明顯增多，少部分真皮內(nèi)亦可見少許色素顆粒，基于此研究，黃褐斑可以分為單純的表皮型和混合型,這對于既往黃褐斑的分型是一個修訂。

2.2 接觸性皮炎 接觸性皮炎根據(jù)發(fā)病機制的不同可以分為刺激性接觸性皮炎和變應性接觸性皮炎兩類。前者是由于皮膚接觸了某種具有刺激性的物質(zhì)后引起皮膚發(fā)疹的一種炎癥反應，絕大多數(shù)人接觸該物質(zhì)后皆可發(fā)??；后者則是對各種產(chǎn)生炎癥反應的物質(zhì)的獲得性過敏反應，而且僅見于以前曾接觸過該變應原的人。兩者臨床表現(xiàn)和組織病理特點極為相似，不易區(qū)分。只有明確區(qū)分后，才能針對不同發(fā)病機制進行不同的治療，可以在明確診斷后，針對不同發(fā)病機制進行不同的治療。RCM可以在體高效地分辨出兩者皮膚的改變。Swindells等[7]用變應原和十二烷硫酸鈉對22例志愿者進行斑貼試驗，并在24，72 h記錄RCM圖像，結(jié)果在刺激性接觸性皮炎和變應性接觸性皮炎中均可見到海綿水腫，表皮炎癥細胞浸潤，水皰形成，與變應性接觸性皮炎不同的是，刺激性接觸性皮炎可以見到角質(zhì)層嚴重斷裂和大量的角化不全細胞。Astner等[8]應用此項技術研究變應性接觸性皮炎的敏感性和特異性,對入選的16例患者的上臂及股內(nèi)側(cè)皮膚進行過敏原及生理鹽水的斑貼試驗，發(fā)現(xiàn)過敏原斑貼區(qū)可見顆粒層及棘層的海綿水腫及炎細胞的移入，其具有95.8%～100%的高特異性，敏感性的范圍在51.9%～96.3%，認為RCM是有前途的非創(chuàng)傷性檢查技術手段之一。Hicks等[9]研究刺激性接觸性皮炎與膚色的關系中，根據(jù)膚色的不同將受試者分組，在前臂掌側(cè)分別以1%和4%的十二烷硫酸鈉作為刺激物，分別在6，24，48 h進行圖像記錄，結(jié)果發(fā)現(xiàn)白種人的臨床表現(xiàn)比黑種人嚴重，進一步印證了深色皮膚對刺激的耐受性比淺色皮膚強。

2.3 銀屑病 是一種常見的炎癥性皮膚病，患者通常接受各種各樣的局部或系統(tǒng)治療。隨著新的免疫調(diào)節(jié)治療方法的不斷出現(xiàn)，迫切需要一種客觀公正的組織病理評價方法。劉華緒等[10]通過對銀屑病皮膚RCM成像及組織病理學分析，發(fā)現(xiàn)銀屑病的幾大特點RCM下均可見到，并與病理結(jié)果高度一致，如角化過度，角化不全，munro微膿腫，顆粒層的消失或變薄，棘層肥厚，真皮乳頭上延，淺層血管扭曲擴張。這種非創(chuàng)傷性檢查可以避免傳統(tǒng)的組織病理檢查中取材對人體的損傷和制片過程中的人為因素的影響，可作為銀屑病診斷及治療隨訪中的有效監(jiān)測工具。Wolberink等[11]在銀屑病皮損光療前、9次光療后、皮損消退時、皮損消退3個月后分別進行RCM成像，并與組織病理學特點相比較，發(fā)現(xiàn)兩者高度一致，認為RCM可在細胞水平上監(jiān)測疾病治療后的反應。

2.4 其他炎癥性皮膚病 劉華緒等[12]通過對光澤苔蘚的組織學和RCM圖像進行對照，首先報告了光澤苔蘚的RCM圖像特點：擴大的真皮乳頭內(nèi)高折光的噬色素細胞和炎細胞浸潤伴有上方的基底層消失。另外，扁平疣、傳染性軟疣等病毒感染的RCM圖像特點也有文獻報告[13]。

2.5 皮膚良惡性腫瘤及癌前期病變

2.5.1 基底細胞癌 基底細胞癌是常見的皮膚腫瘤之一，危害人體健康，早期診斷至關重要，可以降低危害和提高生活質(zhì)量。使用RCM這一既具敏感性又具特異性的非創(chuàng)傷性技術可以做到這一點。Sauermann等[14]對已經(jīng)病理確診的12例BCC病人的皮損進行RCM成像，并與其病理特點進行分析，首次總結(jié)了RCM下BCC的特點，如血管數(shù)目的增加，管腔的擴大，細胞核的拉長并沿一定方向排列等。Nori等[15]在一次回顧性研究中對來自4個組織機構的患者的152處皮膚損害包括良性和惡性制定了5項組織學標準，采用盲法回顧分析了152處皮損的圖像。根據(jù)這5項RCM診斷標準來判斷檢查的敏感性和特異性。結(jié)果有兩項及以上的標準敏感性100%。4項及以上標準的特異性是95.7%，敏感性是82.9%，隨著診斷標準增加提高了特異性降低了敏感性，而RCM在基底細胞癌亞型的鑒別需要進一步研究。Agero等[16]也觀察了色素型基底細胞癌的一些特征，腫瘤細胞在真表皮處緊密聚集形成結(jié)節(jié)狀結(jié)構，瘤細胞在瘤塊周圍排列成柵欄狀，邊界不規(guī)整，折光不均勻，同時伴有明亮的樹枝狀細胞結(jié)構（黑素細胞和朗格漢斯細胞），噬黑素細胞以及高折光的黑素顆粒。

2.5.2 鱗狀細胞癌是發(fā)生于皮膚的一種惡性腫瘤，易沿淋巴組織轉(zhuǎn)移到鄰近組織。Rishpon等[17]對25例鱗癌患者皮膚進行RCM成像分析，發(fā)現(xiàn)表皮細胞排列紊亂，失去其正常的蜂巢樣結(jié)構；真皮淺層的血管橫向擴張是最能提示SCC的關鍵線索。日光性角化病為好發(fā)于暴露部位的一種癌前病變，不經(jīng)治療約20%會發(fā)展成鱗狀細胞癌。Ulrich等[18]對44例病人的46處皮損進行成像分析，發(fā)現(xiàn)與病理對應一致的RCM特點包括：角化不全，細胞排列的紊亂，角質(zhì)形成細胞多形性。其中，結(jié)構紊亂及細胞多形性則能較好地提示日光性角化病。

2.5.3 黑素瘤 黑素瘤是一種惡性程度相當高的皮膚腫瘤，一旦診斷應盡早手術切除。Carrera[19]研究認為黑素瘤在RCM下具有很重要的特征性變化，如表皮上皮可見大量paget樣細胞及樹枝狀細胞；真表皮交界處見不典型的腫瘤細胞巢；真皮乳頭內(nèi)可見形態(tài)不規(guī)則的細胞。色痣是最常見的良性皮膚腫瘤，也是臨床上最容易與黑素瘤混淆的疾病。Pellacani等[20]對180例經(jīng)病理確診的色痣進行RCM成像，發(fā)現(xiàn)其與病理結(jié)果具有高度一致性，交界痣痣細胞聚集在真表皮交界處，皮內(nèi)痣痣細胞團塊位于真皮，混合痣兼具兩者特點。先天性巨大斑疹被認為容易發(fā)展為黑素瘤，Prodinger等[21]研究認為作為一項非侵入性工具，RCM在臨床表現(xiàn)模糊不清的斑疹診斷及病情隨訪中發(fā)揮重大作用，可以明確觀察細胞的活躍程度。

2.5.4 Paget病 又稱濕疹樣癌，分為乳房Paget病及乳房外Paget病，臨床易與濕疹混淆，一旦確診應及早切除，因此早期診斷至關重要。Longo等[22]報道一例色素型乳房Paget病，臨床表現(xiàn)與黑素瘤相似，RCM下發(fā)現(xiàn)表皮上部大量Paget樣細胞，表現(xiàn)為核大，低折光的細胞。Pan等[23]進一步對14例病人的23處皮損進行分析，并與病理學對照，發(fā)現(xiàn)表皮全層均可見Paget樣細胞，具體表現(xiàn)為中等折光的核，其外繞低折光的細胞漿，其體積為正常細胞的兩倍大或者更大；在真表皮交界處，可見腺樣排列的腫瘤細胞巢，他們亦發(fā)現(xiàn)樹枝狀細胞的密度在色素加深區(qū)明顯多于紅斑區(qū)；真皮內(nèi)可見明顯擴張的血管及炎細胞的浸潤。其中表皮內(nèi)Paget樣細胞及真表皮交界處腫瘤細胞巢在明確腫瘤邊界中意義尤為重大。

2.6 皮膚附屬器疾病 Aghassi等[24]對10例皮脂腺增生患者的29處損害使用585 nm脈沖染料激光治療.用RCM觀察了治療前后及隨訪2，4，8周的圖像，結(jié)果發(fā)現(xiàn)損害完全消失者占28%，損害直徑減少者占66%，變平者占93%。Propperova等[25]通過研究發(fā)現(xiàn)皮脂腺RCM下表現(xiàn)為真皮內(nèi)的桑葚樣結(jié)構。Rudnicka等[26]對2例健康對照及6例患有毛發(fā)疾患的患者進行分析，可以觀察毛囊口、毛干的情況，并可以觀察單位面積內(nèi)毛囊的數(shù)量，有助于毛發(fā)疾病的診斷及治療效果的評價。Liu等[27]報告了膠樣粟丘疹的RCM圖像特點：真皮內(nèi)可見低折光的分割區(qū)域。

2.7 Mohs顯微外科 Mohs手術通過每次的切除進行快速冰凍切片檢查，能將對周圍正常組織的損傷降到最小。RCM作為非創(chuàng)傷性檢查可以觀察某些需要Mohs顯微外科手術治療的疾病的損害邊界，以確定手術范圍，特別對惡性黑素瘤、基底細胞癌及一些很難診斷的疾病。如無黑素的黑素瘤、硬化性浸潤性基癌等。這種技術可以明確定位，徹底切除腫瘤，促進了Mohs顯微外科發(fā)展。

綜上所述RCM作為一項新發(fā)展的技術，其非侵入性檢查特點在皮膚科領域?qū)⒂袕V闊的應用前景，RCM正被廣泛地認識和應用，相信隨著這一技術不斷完善和發(fā)展，必將促進對某些難治性皮膚病病因、發(fā)病機制的研究，為診斷和治療提供新的有效的方法，推動皮膚科學發(fā)展。

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