李飛保

青海民和縣疾病預(yù)防控制中心，青海民和 810800

當(dāng)前市場上流行的食品增稠劑越來越多，并且已經(jīng)投入到各類食品的生產(chǎn)，但卻尚未形成一套適用于食品增稠劑的科學(xué)的檢驗方法[1]。在關(guān)于食品添加劑的微生物學(xué)指標(biāo)中，GB13886—2007檢驗法直接引用國家食品安全中的微生物學(xué)檢驗法GB4789進行檢測；但有試驗表明，該檢驗方法對食品增稠劑的檢驗明顯不符合規(guī)范，直接使用會造成檢驗結(jié)果與實際產(chǎn)生偏差，對食品增稠劑的微生物檢驗是否會危害到人體健康這方面的檢驗不科學(xué)。為此，本文專門選取5種高粘稠度的食品增稠劑樣本，進行不同樣品的轉(zhuǎn)種量、濃度以及培養(yǎng)方式三方面的對比試驗，并且對GB4789.4方法中的4類前增菌和增菌方法進行改良，試驗報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

試驗材料：培養(yǎng)基，生化劑，沙門菌，大腸桿菌，志賀菌，金黃色葡萄球菌，刺槐豆膠，果膠，瓜爾膠，結(jié)冷膠，黃原膠，羧甲基纖維素鈉[2]；分別將瓜爾膠、黃原膠、羧甲基纖維素鈉、刺槐豆膠、果膠以及結(jié)冷膠制成1:5的樣品，搖勻，使之在常溫下保持固體凝膠狀態(tài)；標(biāo)準(zhǔn)菌株復(fù)壯后，制成約2CFU/mL備用菌懸液。

1.2 檢出率對比試驗

前增菌：選取沙門菌，稱取20g，分別多次撒于盛有220 mLBPW（緩沖蛋白胨水）的無菌錐形瓶內(nèi)的液面上，使之在短時間可以快速均勻溶解完畢，用該溶液制成1:5的增菌液；再取5g1:5的該增菌液放入85 mLBPW無菌裝置中，900r/min的速度進行無菌操作，大致持續(xù)2 min，停止后將該增菌轉(zhuǎn)移到另一裝置內(nèi)；重復(fù)使用該方法制備濃度為1:500的增均液。三類濃度不一樣的樣品制成后，分別添加1 mL、3 CFU/mL的菌懸液，攪拌使之混合均勻，置于35℃培養(yǎng)觀察15 h。

增菌：分別用無菌長柄勺攪勻培養(yǎng)過的樣品混合物，對三類樣品混合物進行轉(zhuǎn)種，取5g與1g的量到含有5mLTTB的培養(yǎng)裝置內(nèi)，置于43℃培養(yǎng)觀察20h。

1.3 振蕩培養(yǎng)與檢出率的關(guān)系

1.3.1 振蕩培養(yǎng)觀察 試驗組前增菌制備：提取20g原樣品，不同量多次撒于含有220 mLIBPW的無菌裝置液面上，并使之快速溶解，攪拌均勻，制成樣品濃度為1:5的增菌液，取出該10 g濃度為1：5的增菌液放入盛有200 mLBPW的無菌均質(zhì)杯中，繼續(xù)以900r/min的勻質(zhì)速度持續(xù)2 min的無菌操作，停止后將1:50的濃度增菌液轉(zhuǎn)入450 mL的裝置內(nèi)，再分別添加1 mL2x100的菌懸液，攪拌均勻使之溶解，置于35℃實行振蕩培養(yǎng)15 h。

增菌：使用無菌攪拌培養(yǎng)過的增菌液，分別提取8、1 mL的容量，轉(zhuǎn)種于 50 m與5 mLTTB內(nèi)，置于43℃進行振蕩培養(yǎng)20 h。

1.3.2 非振蕩培養(yǎng)觀察 培養(yǎng)方式同振蕩培養(yǎng)，樣本采取完成后進行非振蕩培養(yǎng)20 h。

1.4 評定方法

建立好增稠劑致病菌的適用方法后，對增稠劑常見致病菌微生物的檢驗方法進行改良，即前增菌和增菌的檢驗方法，對其改良后進行比較試驗，使用規(guī)格標(biāo)準(zhǔn)的菌株菌懸液分別對黃原膠樣品逐一進行加標(biāo)檢驗和實際人員比對試驗，各組分別抽取試驗對比有效的結(jié)果以陽性對照組為標(biāo)準(zhǔn)進行對比，將其余3組操作人員的檢出率與標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)進行對比。

對實驗設(shè)置三項對照內(nèi)容，具體為空白對照、陽性對照和樣品對照，每個對照所反映的指標(biāo)各有不同。其中，空白對照不添加任何成分，陽性對照僅添加菌液，而樣品對照也僅添加樣品。成立條件：陽性對照可以檢出，空白對照無法檢出，試驗有效；樣品對照用于觀察樣品的初始染菌狀況。

2 結(jié)果

2.1 不同樣品的濃度、轉(zhuǎn)種量檢出率試驗結(jié)果

經(jīng)過前增菌試驗，刺槐豆膠與果膠樣品都發(fā)生了變化。具體情況：樣品濃度的培養(yǎng)混合物已經(jīng)液化，全部成為液體，樣品對照物發(fā)現(xiàn)有菌類生長，經(jīng)研究其形態(tài)為非加標(biāo)菌形態(tài)，對照樣品已經(jīng)受到別類菌類的侵入，并破壞了加標(biāo)菌的完好生長，嚴(yán)重影響檢出率，因此，該樣品研究無效。此外，其他4種增稠劑樣品，濃度為1:5的樣品檢出率均達不到70%；濃度為1:50的樣品檢出率達不到90%；濃度為1:500的樣品濃度檢出率均能達到100%。

2.2 振蕩培養(yǎng)檢出率試驗結(jié)果

除樣品對照有其他菌類的入侵導(dǎo)致試驗結(jié)果無效以外，其他對照組未出現(xiàn)雜菌，試驗有效。其中，樣品濃度為1:5時，振蕩培養(yǎng)組與非振蕩培養(yǎng)組檢出率都較低；樣品濃度為1:50時，有1/50的轉(zhuǎn)種量同時采用振蕩培養(yǎng)的方式檢出率都能達到100%，試驗結(jié)果表明，當(dāng)前曾增菌培養(yǎng)使用振蕩培養(yǎng)，并且增加濃度到1:50時，檢出率明顯提高，另外，在一些增稠劑中添加適量的轉(zhuǎn)種量也可以有效提高檢出率。

2.3 增稠劑致病菌培養(yǎng)檢驗法的建立

本次試驗結(jié)果表明，有效提高檢出率的辦法，是在取樣量保持一致的情況下[3]，將前增菌和增菌樣品濃度依次降低，使增稠劑樣品在前增菌和增菌的試驗過程完全液化，取得的效果十分顯著。本次試驗方法是在遵循傳統(tǒng)檢驗方法的基礎(chǔ)下進行改良，在操作過程中對各菌類樣本容量、濃度、培養(yǎng)方法等做相應(yīng)調(diào)整，具體方法建立步驟如下：

增稠劑檢驗增容法：前增菌：稱取25g樣品放于盛有2500mLBPW的無菌均質(zhì)杯中，以9000r/min均質(zhì)2min進行無菌操作，將增菌液轉(zhuǎn)移至2500 mL錐形瓶中，置于35℃振蕩培養(yǎng)觀察12 h。

增菌:用長柄無菌勺攪勻已培養(yǎng)過的增菌液，移取5 mL轉(zhuǎn)種于50 mLTTB內(nèi)，置于43℃振蕩培養(yǎng)20 h，同時，另取5 mL增菌液，轉(zhuǎn)種于50 mL混合有亞硝酸鹽胱氨酸的增菌液培養(yǎng)裝置內(nèi)，置于35℃振蕩培養(yǎng)觀察12 h。

2.3.1 增稠劑志賀菌培養(yǎng)法 同樣，稱取25g樣品放入盛有2500 mL志賀氏菌增菌肉湯的均質(zhì)杯中，900r/min均質(zhì)2 min，進行無菌操作將增菌液轉(zhuǎn)移至500 mL錐形瓶中，置于43℃厭氧環(huán)境中振蕩培養(yǎng)20 h。

2.3.2 增稠劑致瀉大腸埃希菌培養(yǎng)法 采集致瀉大腸埃希菌樣品后立即檢驗，取25g樣品，置于2500 mL盛有營養(yǎng)肉湯的無菌質(zhì)裝置內(nèi)，使用9000r/min的均質(zhì)1.5 min實行無菌操作，后轉(zhuǎn)移到5000 mL的錐形瓶中，置于36℃培養(yǎng)6 h；同時取5 mL樣品，轉(zhuǎn)種于50 mL盛有腸道菌增菌的肉湯內(nèi)，置于43℃培養(yǎng)觀察20 h。

2.3.3 增稠劑金黃色葡萄球菌培養(yǎng)法 取25g金黃色葡萄球菌樣品放入盛有2500 mL含有8%的氯化鈉肉湯裝置內(nèi)，以9000r/mind的速度進行2 min的無菌操作，停止后將此增菌液轉(zhuǎn)移至5000 mL的裝置中，置于35℃振蕩培養(yǎng)觀察20 h。

2.4 結(jié)果確認

本次試驗，在4組致病菌檢驗方法中，前增菌和增菌中樣品黃原膠加標(biāo)檢測結(jié)果表明，3組試驗的檢出率都達到100%，在人員比對試驗中達標(biāo)率為100%，方法確認結(jié)果令人滿意。

3 討論

在當(dāng)前的食品市場上，對于食品增稠劑的使用越加廣泛，對于種種增稠劑是否會引入病菌帶到人體成了人們最關(guān)心的問題。國家有相關(guān)部門有規(guī)定，任何使用食品添加劑的單位都要進行許可登記，并索要檢驗情況憑證，如無食品合格證明，則對其按食品食品標(biāo)準(zhǔn)檢驗，嚴(yán)格監(jiān)督。但該檢驗對于食品增稠劑來說卻無法直接操作，在部分檢驗標(biāo)準(zhǔn)中直接采用國家食品安全中的微生物學(xué)檢驗法如GB4789中，經(jīng)科學(xué)研究證明，該檢驗方法不適合直接使用增稠劑致病菌的檢驗。因此，為提高檢驗方法的科學(xué)合理性，完善相關(guān)檢驗法的標(biāo)準(zhǔn)，進一步改良或完善檢驗法十分有必要。實驗過程中，發(fā)現(xiàn)某些雜菌已入侵部分培養(yǎng)菌，導(dǎo)致樣品無效；實驗還發(fā)現(xiàn)，一些增稠劑自身已經(jīng)是某種微生物的代謝物，這些代謝物進入食品，是否會威脅人體健康還需要作進一步研究，而研究的前提則是擁有一套科學(xué)合理的檢驗方法。

在本次食品增稠劑致病菌檢驗方法的試驗可知，通過改變增稠劑前增菌或增菌液的樣品濃度、培養(yǎng)方式以及轉(zhuǎn)重量，可以很大地提高檢出率，采用振蕩培養(yǎng)和增容法、增加轉(zhuǎn)種量的方法，對于提高檢出率也十分有效。其中，振蕩培養(yǎng)極大地促進增菌；增加轉(zhuǎn)種量可避免漏檢；增溶法既可以稀釋樣品濃度，又不會減少試驗樣品的取樣量，所以試驗樣品使用該方法進行檢驗不會造成原理和靈敏度的改變，對檢出結(jié)果不造成影響。因此，對傳統(tǒng)檢驗法進行改良后，操作簡單，結(jié)果讓人滿意，該方法對黏度極高的食品增稠劑致病菌檢驗同樣適用，最后，建議繼續(xù)完善該檢驗法，在國家食品安全標(biāo)準(zhǔn)檢驗法的修訂時，將本次試驗方式添加到相關(guān)內(nèi)容[4]，對其進行完善；也建議相關(guān)部門新建一套專門對食品增稠劑類產(chǎn)品致病菌的檢驗方法，提高檢驗方法的科學(xué)合理性，為食品安全提供有效的保障。

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