楊 靜 王進波 齊莉莉 姜淑貞

(1.浙江大學寧波理工學院，寧波 315100;2.山東農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，泰安 271018)

將菌體預先暴露在較溫和的酸脅迫環(huán)境中進行酸適應，可提高菌體在致死性酸脅迫環(huán)境中的耐受能力，這種能力被稱為細菌的酸耐受應答(ATR)。酸耐受應答能夠提高益生菌對胃酸的耐受力，有助于其順利抵達腸道后段，并在其中黏附、定植，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能［1］。

Goodson等［2］在1989年首先發(fā)現(xiàn)了細菌的酸耐受應答現(xiàn)象，他將埃希氏大腸桿菌放入非致死酸環(huán)境中適應一段時間后，該菌可以在致死酸度下正常存活。Jan等［3］將對數(shù)生長期的費氏丙酸球菌SI41直接置于pH 2.0環(huán)境中，30 min后該菌存活率僅為4.3%;若將此菌在pH 5.0的環(huán)境中培養(yǎng)適應1 h后，再轉(zhuǎn)移至pH 2.0環(huán)境中，活菌數(shù)則沒有顯著降低，說明在此過程該菌產(chǎn)生了酸耐受應答反應。之后，研究人員陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一些有益菌，如乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌等也存在酸耐受應答現(xiàn)象［4］。在酸耐受應答過程中，細菌的能量及代謝狀態(tài)會發(fā)生改變，而這些改變的直接執(zhí)行者即為蛋白質(zhì)。借助蛋白質(zhì)組學技術(shù)鑒定分析細菌在酸耐受應答過程中相關(guān)蛋白表達水平的變化，可以讓人們更直接地了解細菌代謝狀態(tài)的改變。

1 碳水化合物代謝相關(guān)蛋白在酸耐受應答過程中的變化

Zhai等［5］發(fā)現(xiàn)，德氏乳桿菌在酸適應后主要碳水化合物代謝酶發(fā)生差異性表達。利用液-質(zhì)聯(lián)用儀進行的分析表明，該菌中多種與碳水化合物代謝相關(guān)蛋白的表達水平發(fā)生改變，包括糖酵解途徑相關(guān)蛋白，如葡萄糖激酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸變位酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶和丙酮酸激酶等;丙酮酸代謝相關(guān)蛋白，如乙酸激酶;磷酸戊糖途徑相關(guān)蛋白，如6-磷酸葡糖脫氫酶等。丙酮酸對細胞代謝至關(guān)重要，在細胞內(nèi)可被乳酸脫氫酶還原成乳酸供能或被氧化脫羧生成乙酰輔酶A，進而合成脂肪酸［6］。在酸適應階段，保加利亞乳桿菌丙酮酸氧化酶和磷酸乙酰轉(zhuǎn)移酶的表達水平升高，而乳酸脫氫酶的表達水平?jīng)]有顯著變化。這意味著乳酸合成減少，乙酰輔酶A產(chǎn)量增加，使得細胞膜脂肪酸的合成增多。這種改變增加了細胞膜的剛性和抗?jié)B性，使得細胞膜對質(zhì)子的滲透性降低，以對抗酸性條件下的質(zhì)子涌入［7-8］。在酸適應階段，其他乳酸桿菌中也存在類似的丙酮酸代謝改變的情況［9-10］。

Wu等［11］報道，在酸脅迫過程中，干酪乳桿菌體內(nèi)8種參與碳水化合物代謝的蛋白表達上調(diào)，包括N-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶(N-acetyl-glucosamine deacetylase，NagA)、氨基葡萄糖脫氨酶(glucosamine deaminase，NagB)、磷酸葡萄糖變位酶、磷酸葡糖胺變位酶、乳酸脫氫酶、二磷酸硫胺素輔羧酶、半乳糖變旋酶和磷酸烯醇丙酮酸蛋白磷酸轉(zhuǎn)移酶。其中，NagA催化6-磷酸-N-乙酰-D-葡糖胺和6-磷酸-D-果糖的代謝，而6-磷酸-N-乙酰-D-葡糖胺是N-乙酰-D-葡糖胺和二磷酸尿苷(uridine diphosphate，UDP)-N-乙酰胞壁酸的前體，這2種物質(zhì)是細胞壁肽聚糖生物合成所必需的，這表明這些酶的表達水平升高可能與膜受損后的修復有關(guān)。有研究推測，干酪乳桿菌中NagB的表達上調(diào)或許與細胞質(zhì)pH的動態(tài)平衡有關(guān)。其他6種蛋白與糖酵解相關(guān)，這些蛋白的表達上調(diào)說明酸脅迫后的干酪乳桿菌糖酵解加強。Chen等［12］發(fā)現(xiàn)，酸脅迫后的干酪乳桿菌，其H+-ATP酶的表達升高，可以推測在酸脅迫過程中，干酪乳桿菌糖酵解加強，ATP合成增多;同時，H+-ATP酶利用ATP水解釋放的能量將胞內(nèi)質(zhì)子運送出細胞，從而維持細胞質(zhì)內(nèi)外pH的動態(tài)平衡。對乳酸乳球菌的研究也發(fā)現(xiàn)了類似的現(xiàn)象［13］，NagB濃度的迅速升高使得乳酸乳球菌可以利用牛奶中的N-乙酰葡糖胺作為替代碳源誘導細胞內(nèi)氨的產(chǎn)生，氨可以用于菌體內(nèi)含氮分子的生物合成或者維持細胞質(zhì)pH的動態(tài)平衡。

2 分子伴侶、氨基酸代謝及核糖體蛋白在酸耐受應答過程中的變化

Wu等［11］指出，干酪乳桿菌中熱休克蛋白DnaK為酸誘導蛋白，在蛋白質(zhì)的成熟、降解及修復中扮演重要角色。保加利亞乳桿菌的2種翻譯延伸因子熱不穩(wěn)定延伸因子(elongation factor thermo unstable，EF-Tu)、延伸因子 G(elongation factor G，EF-G)在酸脅迫時表達上調(diào)，干酪乳桿菌中也存在類似的情況。除在蛋白質(zhì)翻譯中的作用外，EF-Tu、EF-G在蛋白質(zhì)的折疊中具有類似于分子伴侶的功能，而且核糖體和氨酰tRNA-EF-Tu之間的相互作用對控制翻譯的準確性具有重要作用［5］。EF-Tu、EF-G 在酸脅迫時的表達上調(diào)有利于保證酸脅迫環(huán)境下菌體內(nèi)蛋白質(zhì)合成過程中的準確翻譯及正確折疊。

當細胞克服酸性環(huán)境時，細胞內(nèi)氨基酸合成會受到限制，可能是由于這一過程中的ATP結(jié)合效率降低［14-15］。細胞內(nèi)氨基酸濃度的降低可能會引起細胞通過其他途徑來獲取氨基酸，如通過肽酶(Pep)或者肽轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的過量表達途徑。保加利亞乳桿菌的2種肽酶(PepN和PepO1)在酸脅迫時表達上調(diào)［5］，鼠李糖乳桿菌、干酪乳桿菌等也存在同樣的情況［10-11］。Sánchez 等［16］發(fā)現(xiàn)，長雙歧桿菌在pH 4.8環(huán)境下，其PepP的表達水平高于pH 7.0環(huán)境下。在酸脅迫環(huán)境下，干酪乳桿菌中PepT、PepF、PepD3和PepN等幾個肽酶的表達也被誘導［11］。Zhai等［5］推測這些肽酶可能會與Clp蛋白酶合作，降解酸脅迫導致的錯誤折疊的蛋白質(zhì)，釋放出氨基酸，然后循環(huán)利用生成新的蛋白質(zhì)。

酸脅迫環(huán)境中，保加利亞乳桿菌的2種核糖體蛋白RpiM、RpsS表達水平升高，穩(wěn)定生長期的干酪乳桿菌核糖體大亞基蛋白中L10的表達水平下調(diào)，小亞基蛋白中S2的表達水平上調(diào)［17］。核糖體蛋白被認為是熱休克和冷休克的傳感器［18］，可能也與酸耐受應答有關(guān)。

3 p H傳感及自適應調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白在酸耐受應答過程中的變化

一般而言，細菌相關(guān)信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)感知環(huán)境的變化，這些信號刺激細胞內(nèi)的各種反應機制，從而引發(fā)細菌代謝上的適應性變化。其中，由膜結(jié)合型傳感器和細胞質(zhì)內(nèi)的調(diào)控效應子組成的雙組分信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)(two-component signal transduction system，TCSTS)對于細菌的適應和存活是必不可少的。保加利亞乳桿菌體內(nèi)存在5個完整的TCSTS。在這些系統(tǒng)中，一種類似于VicK/VicR的信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)可以感知酸脅迫并作出反應。酸性環(huán)境觸發(fā)了VicK樣受體及同源調(diào)控子VicR樣蛋白的磷酸化，磷酸化的VicR樣蛋白進而活化或阻遏pH應答基因的表達，進行自適應調(diào)節(jié)［5］。

此外，在乳酸菌對酸耐受應答的反應中，幾種轉(zhuǎn)錄調(diào)控子在協(xié)調(diào)基因表達調(diào)控方面發(fā)揮重要作用，如參與碳水化合物代謝的CggR阻遏蛋白。另外，在保加利亞乳桿菌中，還發(fā)現(xiàn)一種潛在的未知功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子Ldb0677參與酸耐受應答，該因子在酸適應階段表達水平上調(diào)，Ldb0677的過度表達提高了細菌的酸耐受性。關(guān)于Ldb0677的具體調(diào)控過程及功能，還需要進一步研究。

4 小結(jié)

目前為止，益生菌的酸耐受應答可能的機制有質(zhì)子泵、產(chǎn)生堿性物質(zhì)、受損蛋白質(zhì)的修復、受損DNA的修復、細胞膜成分的改變等［19］。而蛋白質(zhì)組學分析是進一步了解這些機制的重要工具，對于提高益生菌的耐酸力，解決益生菌在胃腸道存活率偏低的現(xiàn)象具有十分重要的意義。

［1］ 陳衛(wèi)，譚惠子，胡斌，等.益生菌對消化道胃酸和膽鹽脅迫的應激機理［J］.中國食品學報，2010，10(6):1-6.

［2］ GOODSON M，ROEBURY R J.Habituation to normally lethal acidity by prior growth of Escherichia coli at a sub-lethal acid pH value［J］.Letters in Applied Microbiology，1989，8(2):77-79.

［3］ JAN G，LEVERRIER P，PICHEREAU V，et al.Changes in protein synthesis and morphology during acid adaptation of Propionibacterium freudenreichii［J］.Applied and Environmental Microbiology，2001，67(5):2029-2036.

［4］ 劉懷龍，孟祥晨，莊翹楚.益生菌酸性應激的研究進展［J］.食品工業(yè)科技，2008(6):300-303.

［5］ ZHAI Z Y，DOUILLARD F P，AN H，et al.Proteomic characterization of the acid tolerance response in Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus CAUH1 and functional identification of a novel acid stress-related transcriptional regulator Ldb0677［J］.Environmental Microbiology，2013，16(6):1524-1537.

［6］ SAUER U，EIKMANNSB J.The PEP-pyruvate-oxaloacetate node as the switch point for carbon flux distribution in bacteria［J］.FEMS Microbiology Reviews，2005，29(4):765-794.

［7］ FERNANDEZ A，OGAWA J，PENAUD S，et al.Rerouting of pyruvate metabolism during acid adaptation in Lactobacillus bulgaricus［J］.Proteomics，2008，8(15):3154-3163.

［8］ ZHANG Y M，ROCK C O.Membrane lipid homeostasis in bacteria［J］.Nature Reviews Microbiology，2008，6(3):222-233.

［9］ BROADBENT J R，LARSEN R L，DEIBEL V，et al.Physiological and transcriptional response of Lactobacillus casei ATCC 334 to acid stress［J］.Journal of Bacteriology，2010，192(9):2445-2458.

［10］ KOPONEN J，LAAKSO K，KOSKENNIEMI K，et al.Effect of acid stress on protein expression and phosphorylation in Lactobacillus rhamnosus GG［J］.Journal of Proteomics，2012，75(4):1357-1374.

［11］ WU R，ZHANG W，SUN T，et al.Proteomic analysis of responses of a new probiotic bacterium Lactobacillus casei Zhang to low acid stress［J］.International Journal of Food Microbiology，2011，147(3):181-187.

［12］ CHEN X，YANG M，SUN Z H，et al.Molecular cloning and characterisation of alpha subunit of H+-ATPase in Lactobacillus casei Zhang［J］.Czech Journal of Food Sciences，2009，27(1):49-54.

［13］ EVEN S，LINDLEY N D，LOUBIèRE P，et al.Dynamic response of catabolic pathways to autoacidification in Lactococcus lactis:transcript profiling and stability in relation to metabolic and energetic constraints［J］.Molecular Microbiology，2002，45(4):1143-1152.

［14］ POOLMAN B，DRIESSEN A J，KONINGS W N.Regulation of solute transport in streptococci by external and internal pH values［J］.Microbiological Reviews，1988，51(4):498-508.

［15］ BUDIN-VERNEUIL A，PICHEREAU V，AUFFRAY Y，et al.Proteomic characterization of the acid tolerance response in Lactococcus lactis MG1363［J］.Proteomics，2005，5(18):4794-4807.

［16］ SáNCHEZ B，CHAMPOMIER-VERGèS M C，DEL CARMMEN C M，et al.Low-pH adaptation and the acid tolerance response of Bifidobacterium longum biotype longum［J］.Applied and Environmental Microbiology，2007，73(20):6450-6459.

［17］ WU R，WANG W，YU D，et al.Proteomics analysis of Lactobacillus casei Zhang，a new probiotic bacterium isolated from traditional home-made koumiss in Inner Mongolia of China［J］.Molecular ＆ Cellular Proteomics，2009，8(10):2321-2338.

［18］ JONES P G，MITTA M，KIM Y，et al.Cold shock induces a major ribosomal-associated protein that unwinds double-stranded RNA in Escherichia coli［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1996，93(1):76-80.

［19］ 金君華，張昊，郭慧媛，等.乳酸菌酸脅迫應答機制研究進展［J］.中國乳業(yè)，2012(11):32-35.