郭丹丹，章以杰*，劉志成，常國江，林 俊，田苗苗，宋曉麗，王 彬

0 引言

急性腦梗死是老年人的常見病之一，除了出現(xiàn)偏癱、失語、吞咽困難等癥狀外，還可出現(xiàn)認知功能障礙等癥狀，進一步影響了患者的生活和工作質(zhì)量。有研究顯示，認知功能障礙是急性腦梗死幸存者最常見的并發(fā)癥之一，急性腦梗死后1周時，認知功能障礙的發(fā)生率為61%，6個月時仍有37%的患者遺留認知功能障礙[1]。因此，在腦梗死早期，如何治療患者認知功能障礙，改善患者生活質(zhì)量是近年來臨床研究的熱點。硫化氫(H2S)是繼一氧化氮和一氧化碳之后發(fā)現(xiàn)的第3種氣體信號分子。近年來，該分子在哺乳動物各系統(tǒng)發(fā)揮的生理和病理調(diào)節(jié)作用越來越受到人們的重視，大量研究表明，外源性H2S能改善癲疒間大鼠的學習記憶能力[2]。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)是細胞和全身最重要的維持能量平衡的物質(zhì)[3]。有研究顯示，海馬AMPK水平升高是老齡大鼠脾切除術(shù)后認知功能障礙形成時機體的適應(yīng)性調(diào)節(jié)機制[4]。星形膠質(zhì)細胞是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)數(shù)量最多、分布最廣、體積最大的一類神經(jīng)細胞。研究顯示，老年患者由于星形膠質(zhì)細胞合成和分泌能力下降，對神經(jīng)元的支持營養(yǎng)能力也相應(yīng)下降，同時，對Aβ攝取和降解的能力也下降，而手術(shù)創(chuàng)傷可能加重這種退行性改變，從而導(dǎo)致腦功能障礙，引起認知功能下降[5]。本研究擬評價硫化氫對老齡急性腦梗死大鼠海馬神經(jīng)元腺苷酸活化蛋白激酶和星形膠質(zhì)細胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康雄性老齡SD大鼠96只(長沙市藥物檢驗檢疫局提供)，體質(zhì)量450～550 g，采用隨機數(shù)字表法，將其隨機分為4組：對照組(C組)、模型組(O組)、生理鹽水+模型組(S組)、H2S組+模型組(H組)，每組24只。參照文獻[6]采用線栓法致大鼠大腦中動脈阻塞致急性腦梗死模型。H組于制作模型前25 min給予大鼠腹腔注射H2S外源性供體NaHS(14 μmol/kg)；S組于制作模型前25 min給予大鼠腹腔注射注入等量的生理鹽水；C組不行任何處理。

1.2 方法 采用Morris水迷宮測試大鼠，在制備模型前5 d開始Morris水迷宮學習，每天于同一時間段進行，剔除有明顯運動障礙的大鼠。測試用圓形水池直徑，120 cm，高40 cm；圓柱形平臺，直徑10 cm，高30 cm。室溫及水溫均保持在24～26 ℃。第1～4天每天從東、南、西、北4個等距離點中選一點將動物面向池壁放入，其游泳圖像經(jīng)水面上方2 m處攝像機拍攝并連接于路徑追蹤系統(tǒng)進行采集。訓練前將老年大鼠先放于平臺20 s，再面對池壁放入迷宮，每次游泳時限為90 s，在90 s內(nèi)未找到平臺者系統(tǒng)自動停止記錄，潛伏期記為90 s，由測試者引導(dǎo)其上臺，休息20 s后進行下一次訓練。在第5天每一點連續(xù)訓練2次，用平均成績作為術(shù)前成績。測試完成后，各組大鼠進行相應(yīng)處理，于制備模型前第5天(T)用與制備模型后1、3、5 d(T1、T3、T5)測試相同的方法進行行為學測定。選用逃避潛伏期和游泳路徑作為大鼠學習和記憶測試的指標。

采用RT-PCR法測定大鼠海馬內(nèi)AMPK mRNA的表達，于制備模型后1、3、5 d水迷宮測試結(jié)束后，隨機從各組取8只大鼠，腹腔注射10%水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉后，迅速置于冰上斷頭取腦，分離海馬組織，-80 ℃冰箱保存。海馬組織RNA的提取，采用RNA提取試劑盒法(天根公司，北京中國)。取RNA產(chǎn)物1.0 μg，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根公司，北京中國)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；引物設(shè)計：AMPK-α上游5′-GCTGTGGATCGCCAAATTAT-3′和下游5′-GCATCAGCAGAGTGGCAATA-3′共222 bp。內(nèi)參選用β-actin：上游5′-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3′和下游5′-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3′rt-PCR采用rt-PCR試劑盒(天根公司，北京中國)，反應(yīng)條件都是：第一步：預(yù)變性95 ℃ 5 min；第二步：變性95 ℃ 20 s，退火56 ℃ 20 s，延伸75 ℃ 30 s，40循環(huán)；第三步：75 ℃ 7 min。得到擴增曲線和溶解曲線。采用Western-blot法測定大鼠海馬內(nèi)AMPK、p-AMPK的表達：海馬組織加入細胞裂解液和蛋白酶抑制劑PMSF(碧云天生物試劑研究所，中國)進行冰上裂解2 h后，超聲裂解、低溫離心取上清液95 ℃變性5 min，放入-20 ℃凍存。檢測p-AMPK指標的組織裂解時，另需加入磷酸酶抑制劑(碧云天生物技術(shù)研究所，中國)。選用12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)至PVDF膜(Millipore公司，美國)，加一抗，置于搖床上(Thermo公司，美國)室溫孵育2 h，PBST充分漂洗后，加入辣根過氧化酶標記的二抗(1∶6 000,北京中杉金橋科技公司)室溫搖床孵育1 h，膜與化學發(fā)光底物孵育后顯影照相。圖像用Quantity one 圖像分析軟件(Bio Rad公司，美國)測定AMPK、p-AMPK的表達。

采用免疫組織化學法計數(shù)GFAP陽性細胞總個數(shù)[7]。將rt-PCR剩余的海馬組織化凍后，進行福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋切片，脫蠟用二甲苯脫蠟3次，每次5 min；水化用無水乙醇2次，每次3 min，95%的酒精2次，每次3 min，85%的酒精1次，每次3 min。自來水沖洗20 s；PBS液洗滌4次，每次4 min；1∶100的檸檬酸高壓鍋開蓋沸騰后，放入切片，蓋鍋蓋高壓維持3 min進行修復(fù)；PBS洗滌4次，每次4 min；雙氧水1滴滴在切片有組織處，并完全蓋住組織進行滅內(nèi)菌酶10 min；PBS洗滌4次，每次4 min；加入1∶100的一抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)抗體一滴滴在有組織處，并完全蓋住組織，放入37 ℃溫箱中卵巢育1 h；PBS洗滌4次，每次4 min，加二抗羊血清一滴在組織處并完全蓋過組織，室溫下卵巢育20 min；PBS洗滌4次，每次4 min；加顯影劑2 min，觀察胞漿染色出現(xiàn)褐色沉著后，迅速用自來水沖洗停止顯影；蘇木素染色5 s；自來水沖洗；85%酒精3 min，95%酒精3 min；無水乙醇3 min，二甲苯脫水2次，每次3 min，用凝膠封片晾干保存。選取10個在高倍鏡下較清晰且無視野缺損的視野，計數(shù)GFAP陽性細胞總個數(shù)。

2 結(jié)果

與C組比較，O組、S組、H組大鼠逃避潛伏期和游泳路徑延長(P<0.05)；與O組、S組比較，H組大鼠逃避潛伏期和游泳路徑縮短(P<0.05);與制備模型前比較，O組、S組、H組制備模型后1、3、5 d大鼠逃避潛伏期和游泳路徑延長(P<0.05);制備模型前各組、O組與S組大鼠逃避潛伏期和游泳路徑比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表1。

表1 四組大鼠各時點逃避潛伏期和游泳路徑的比較

與C組比較，O組、S組、H組大鼠海馬AMPK mRNA、AMPK、p-AMPK表達上調(diào)(P<0.05);與O組、S組比較，H組大鼠海馬AMPK mRNA、AMPK、p-AMPK表達下調(diào)(P<0.05);O組與S組大鼠海馬AMPK mRNA、AMPK、p-AMPK表達比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

與C組比較，O組、S組、H組大鼠海馬GFAP表達細胞數(shù)量增多(P<0.05);與O組、S組比較，H組大鼠海馬GFAP表達細胞數(shù)量減少(P<0.05);O組與S組大鼠海馬GFAP表達細胞數(shù)量比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3。四組大鼠T1、T3、T5時，海馬GFAP陽性神經(jīng)元見圖1～圖3。

表2 四組大鼠各時點海馬AMPK mRNA、AMPK和p-AMPK表達水平比較

3 討論

參照文獻[8]選擇腹腔注射NaHS(14 μmol/kg)。Morris水迷宮實驗是評價嚙齒類動物空間學習記憶功能的經(jīng)典方法，其定位航行實驗中的逃避潛伏期可反映獲取空間信息記憶能力；空間探索實驗中游泳路徑反映獲取空間信息的記憶存儲能力。本研究參照文獻[9]制備大鼠模型，結(jié)果表明，與C組比較，O組逃避潛伏期和游泳路徑延長，提示老齡大鼠出現(xiàn)了認知功能障礙，表明老齡急性腦梗死大鼠認知功能障礙模型制備成功。

表3 四組大鼠各時點海馬GFAP表達細胞數(shù)量比較

圖1 四組大鼠T1時海馬GFAP陽性神經(jīng)元

圖2 四組大鼠T3時海馬GFAP陽性神經(jīng)元

圖3 四組大鼠T5時海馬GFAP陽性神經(jīng)元

海馬是掌管認知功能的重要區(qū)域。血腦屏障作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周血液循環(huán)的屏障，能防止循環(huán)血液中的大多數(shù)大分子物質(zhì)通過，保護海馬組織不受損傷。研究表明，星形膠質(zhì)細胞激活后可導(dǎo)致血腦屏障通透性的改變，而外周炎性反應(yīng)可以直接通過血腦屏障進入中樞對海馬造成損害[10]。GFAP是星形膠質(zhì)細胞內(nèi)的重要蛋白，激活的星形膠質(zhì)細胞表達GFAP明顯增多，因此，GFAP是AS星形膠質(zhì)細胞激活的標志。AMPK是由催化亞基α、調(diào)節(jié)亞基β和γ組成的異源三聚體，其中α1、α2亞基廣泛存在于大腦[11]。認知功能障礙的病理特征主要是海馬區(qū)域神經(jīng)元微管相關(guān)蛋白tau 的過度磷酸化[12]。研究表明，AMPK可通過調(diào)控tau蛋白磷酸化，參與AD的發(fā)生和發(fā)展[13]。

本研究結(jié)果表明，老齡大鼠急性腦梗死后1、3、5 d逃避潛伏期和游泳路徑延長，海馬AMPK mRNA、AMPK、p-AMPK表達上調(diào)，GFAP表達細胞數(shù)量增多，提示急性腦梗死后，可造成老齡大鼠認知功能障礙；而H組較O組急性腦梗死后1、3、5 d逃避潛伏期和游泳路徑縮短，海馬AMPK mRNA、AMPK、p-AMPK表達下調(diào)，GFAP表達細胞數(shù)量減少，提示H2S可改善老齡大鼠術(shù)后認知功能障礙，其機制可能是：急性腦梗死后可引起炎癥反應(yīng)，從而導(dǎo)致星形膠質(zhì)細胞作為神經(jīng)免疫細胞被激活[14]，而H2S可抑制LPS誘導(dǎo)的RAW26417巨噬細胞NO的產(chǎn)生和NF-κB的表達,從而調(diào)節(jié)細胞內(nèi)炎癥介質(zhì)的釋放,發(fā)揮抗炎癥的功能[15]，抑制星形膠質(zhì)細胞的激活。此外，H2S可通過調(diào)節(jié)腦血管壁平滑肌張力來調(diào)節(jié)大腦血供，進而間接影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能[16-18]，從而使 ATP/AMP比例增加，抑制AMPK磷酸化和AMPK的激活，減少tau蛋白磷酸化[19]，改善認知功能障礙。

綜上所述，H2S可通過下調(diào)海馬神經(jīng)元腺苷酸活化蛋白激酶和抑制星形膠質(zhì)細胞激活，改善老齡急性腦梗死大鼠認知功能，為臨床上急性腦梗死后認知功能障礙的治療提供了新思路。

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