李全斌，張昌文，吳建萍，錢洪波，李紀(jì)元

0 引言

活血定痛合劑(HXDTM)為醫(yī)院協(xié)定處方制備的中藥復(fù)方醫(yī)院制劑，由丹參、赤芍、當(dāng)歸、川芎、紅花、生地、桃仁、蘇木、陳皮、枳殼、瓜蔞等十多味中藥制成，前期藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了HXDTM具有良好的抗炎、鎮(zhèn)痛及改善微循環(huán)作用[1-5]。該制劑中諸藥合用,可主治因氣滯血瘀之痛癥、跌打損傷、骨折腫痛等，具有活血化瘀、消腫止痛之功效，療效確切。丹參作為我國(guó)傳統(tǒng)的中藥材之一，其有效成分復(fù)雜，組方中丹參的水溶性酚酸類化合物(均具有鄰二酚羥基苯甲醛的結(jié)構(gòu))，如丹參素、原兒茶醛和丹酚酸B等，以及脂溶性的二萜醌類化合物，如丹參酮Ⅰ、二氫丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA、隱丹參酮等，在丹參的生物學(xué)活性方面占有重要的地位，因此，可用于丹參制劑的質(zhì)量控制與評(píng)價(jià)[6]。

活血定痛合劑采用水提工藝制備，用薄層色譜對(duì)HXDTM中的當(dāng)歸、川芎、紅花、赤芍、丹參等進(jìn)行定性鑒別，通過(guò)在室溫下留樣試驗(yàn)考察該制劑的外觀、性狀、鑒別以及微生物限度等項(xiàng)目，表明該制劑質(zhì)量穩(wěn)定[7]。但該制劑中脂溶性成分丹參酮ⅡA含量很低，難以檢測(cè)，為了進(jìn)一步有效地控制活血定痛合劑的質(zhì)量，確保臨床用藥安全、有效，本實(shí)驗(yàn)以丹參中的水溶性活性成分丹參素鈉和原兒茶醛作為含量測(cè)定的考察指標(biāo)，用高效液相色譜法測(cè)定活血定痛合劑中二者含量，方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，結(jié)果滿意，為控制活血定痛合劑的質(zhì)量提供了可靠實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilentl100高效液相色譜儀(美國(guó)安捷倫)，Agilent紫外檢測(cè)器，Agilent色譜化學(xué)工作站，Agilent Eclipse XDB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，XS-104微量分析天平(瑞士梅特勒公司)，摩爾純水機(jī)，UV-2201(日本島津)，Sartorius CP225D分析天平(德國(guó)Sartorius公司)。

1.2 試藥 丹參素鈉和原兒茶醛對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，含量測(cè)定用，批號(hào)：110855-200507、l10810-200506)，HXDTM及陰性對(duì)照品(自制，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬荊州醫(yī)院制劑室提供處方，規(guī)格:500 mL/瓶，批號(hào)：20120628、20120816和20121012)，甲醇(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，冰醋酸(分析純，北京化工廠)，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，Agilent公司；流動(dòng)相:乙腈-0.5%冰醋酸(25∶75)；柱溫:35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng):280 nm流速:1.0 mL/min；進(jìn)樣量:10 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 精密稱取丹參素鈉(經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h)對(duì)照品8.4 mg，置于25 mL量瓶中，用0.5%冰醋酸水溶液溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.336 g/L的丹參素鈉對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

精密稱取原兒茶醛(經(jīng)五氧化二磷減壓干燥24 h)對(duì)照品3.2 mg，置于25 mL量瓶中，用0.5%冰醋酸水溶液溶解并定容至刻度，制成質(zhì)量濃度為0.128 g/L的原兒茶醛對(duì)照品儲(chǔ)備溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取HXDTM 1 mL，置于10 mL量瓶中，用0.5%冰醋酸水溶液稀釋至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備 按HXDTM的處方及制備工藝制備不含丹參藥材的陰性樣品，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備，即得陰性對(duì)照溶液。

2.3 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下質(zhì)量濃度為0.336 g/L丹參素鈉對(duì)照品儲(chǔ)備溶液5 mL和質(zhì)量濃度為0.128 g/L的原兒茶醛對(duì)照品儲(chǔ)備溶液5 mL，置于10 mL的棕色量瓶中，制得含丹參素鈉168.00 μg/mL和原兒茶醛的質(zhì)量濃度為64.00 μg/mL的混合溶液，取上述混合溶液5、2.5 mL置于10 mL的棕色量瓶中，用0.5%醋酸水溶液定容稀釋，可以制得含丹參素鈉42.00、84.00 μg/mL和原兒茶醛的質(zhì)量濃度為16.00、32.00 μg/mL的混合溶液，如此操作可以制得含丹參素鈉5.25、10.50、21.00 μg/mL和原兒茶醛的質(zhì)量濃度為2.00、4.00、8.00 μg/mL的系列混合溶液，在上述色譜條件下操作，進(jìn)樣量為10 μL，以丹參素鈉、原兒茶醛峰面積(A)為縱坐標(biāo)，以丹參素鈉、原兒茶醛質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，丹參素鈉與原兒茶醛的回歸方程分別為：A1=3.915×104C1-6.912×102，r=0.998 9；A2=5.453×105C2-6.569×103，r=0.999 3。

結(jié)果表明：丹參素鈉與原兒茶醛進(jìn)樣量分別在5.25～168.00 μg/mL和2.00～64.00 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

2.4 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 按上述色譜條件下，取線性關(guān)系項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液，設(shè)定進(jìn)樣次序。記錄HPLC圖，在以上色譜條件下，丹參素和原兒茶醛與其他色譜峰能達(dá)到較好的分離，丹參素鈉保留時(shí)間約8.9 min，原兒茶醛保留時(shí)間為15.9 min；理論塔板數(shù)按丹參素計(jì)算不低于4 000，按原兒茶醛計(jì)算不低于5 000；陰性對(duì)照品溶液在丹參素和原兒茶醛吸收峰的位置上均無(wú)吸收峰，供試品溶液中丹參素鈉、原兒茶醛可達(dá)到基線分離，峰形對(duì)稱，陰性對(duì)照品溶液無(wú)干擾，基線穩(wěn)定，方法可行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖1。

2.5 精密度試驗(yàn) 取線性關(guān)系項(xiàng)下的同一混合對(duì)照品溶液(含丹參素鈉42.00 μg/mL，原兒茶醛16.00 μg/mL)10μL，在擬定的色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，計(jì)算得丹參素鈉和原兒茶醛的RSD(n=6)分別為1.06%和1.09%，結(jié)果表明該儀器精密度良好。

2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取HXDTM(批號(hào)：20110216)適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，在上述色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣5次，記錄丹參素鈉和原兒茶醛的峰面積，計(jì)算得到RSD分別為0.92%和0.87%，結(jié)果表明該測(cè)定方法的重現(xiàn)性符合要求。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取HXDTM(批號(hào)：20110216)適量，室溫放置，按上述色譜條件，分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣分析，測(cè)定峰面積，丹參素鈉和原兒茶醛的RSD(n=6)分別為1.62%和1.49%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 HXDTM的高效液相色譜圖

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取已知丹參素鈉和原兒茶醛含量的HXDTM樣品(批號(hào)：20110221)9份，每份1 mL，按大約樣品含量的20%、40%、80%分別加入線性關(guān)系項(xiàng)下的丹參素鈉及原兒茶醛適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在上述色譜條件下，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1，表明方法的回收率良好。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)

2.9 樣品含量測(cè)定 取3批HXDTM樣品(批號(hào)：20120628、20120816、2011012)，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，樣品量為10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述高效液相色譜條件進(jìn)樣，記錄色譜圖，按外標(biāo)法計(jì)算HXDTM中丹參素鈉和原兒茶醛的含量，結(jié)果見表2。

根據(jù)上述結(jié)果，考慮到每批藥材的產(chǎn)地、質(zhì)量及生產(chǎn)過(guò)程中純化水用量及藥材的稱量等所帶來(lái)的誤差，暫定本品中每100 mL含丹參素不得少于9.0 mg，含原兒茶醛不得少于1.2 mg。

表2 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 丹參的水溶性成分丹參素和原兒茶醛均是酚酸類化合物，極性大，在水溶液中易溶解，與空氣接觸極易氧化成醌式結(jié)構(gòu)化合物，在偏堿溶液時(shí)更易氧化，使溶液呈桔黃色，在中性流動(dòng)相中存在著離解平衡而使測(cè)定的結(jié)果偏低且色譜峰易產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，所以，目前在測(cè)定上述兩種物質(zhì)時(shí)，在流動(dòng)相中加入適量酸，既抑制其氧化也可抑制其拖尾，乙腈能使色譜峰保持良好的峰形[8-9]。在實(shí)驗(yàn)初期，考察甲醇-磷酸水溶液、甲醇-冰醋酸水溶液、甲醇-乙腈-冰醋酸水溶液[10-16]及不同比例等多個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)的效果，均難以獲得較好的分離度和峰形，結(jié)果選擇乙腈-0.5%冰醋酸作為流動(dòng)相，分離效果較好[17-18]。

3.2 流動(dòng)相比例的確定 實(shí)驗(yàn)中考察了混合對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)溶液(“2.3”線性關(guān)系考察項(xiàng)下方法制備)在不同比例的乙腈與0.5%冰醋酸的流動(dòng)相體系下的出峰時(shí)間及峰形等的分離效果，在幾個(gè)不同流動(dòng)相比例1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5的分離效果中，以乙腈-0.5%冰醋酸為1∶3時(shí)分離效果最優(yōu)，峰形對(duì)稱，柱效高，保留時(shí)間適宜，干擾成分少，丹參素鈉、原兒茶醛均可達(dá)到基線分離。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 實(shí)驗(yàn)是在同一色譜系統(tǒng)中對(duì)丹參素鈉和原兒茶醛同時(shí)檢測(cè)，因此，找到二者共同的最大吸收波長(zhǎng)選擇尤為重要。實(shí)驗(yàn)中將丹參素鈉和原兒茶醛對(duì)照品溶液分別在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行紫外掃描，丹參素鈉和原兒茶醛均在280 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，且吸收良好，利于含量測(cè)定，故選用280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)；流動(dòng)相比例確定以后，考察了流動(dòng)相對(duì)兩種活性成分丹參素鈉和原兒茶醛在280 nm吸收的影響，結(jié)果影響不明顯。

3.4 柱溫的確定 柱溫對(duì)于分離的效能也有影響，合適的柱溫能調(diào)整保留時(shí)間，提高分離度，在擬定的色譜條件下，調(diào)整柱溫在室溫及30、35、40、50 ℃條件下分別進(jìn)樣分析，考察柱溫對(duì)分離的影響，結(jié)果表明：理論塔板數(shù)N基本隨著溫度升高而增大；隨著柱溫升高，各物質(zhì)峰的保留時(shí)間均逐漸提前，這可能是由于溫度升高使化合物在兩相之間的分子運(yùn)動(dòng)加快引起；分離度R在室溫時(shí)較差，其余溫度下影響不大；不對(duì)稱性因子S除室溫和50 ℃較大外，其他均比較理想，故在30～40℃范圍內(nèi)均為適合的柱溫。但考慮到升溫導(dǎo)致色譜柱的穩(wěn)定性差、壽命低，綜合考慮選擇35 ℃為測(cè)定柱溫。

3.5 柱長(zhǎng)的選擇 在相同色譜條件下，色譜柱長(zhǎng)短不一樣時(shí)，柱子越長(zhǎng)，保留時(shí)間就越長(zhǎng)。柱長(zhǎng)選用150 mm，丹參素鈉的保留時(shí)間為5.30 min左右；柱長(zhǎng)選用250 mm，其保留時(shí)間為8.90 min左右，色譜柱內(nèi)徑小對(duì)色譜峰分離效果要好，但測(cè)試中產(chǎn)生的壓力也高。因此，實(shí)驗(yàn)選用柱長(zhǎng)以250 mm為好。

3.6 流動(dòng)相的速度 在相同色譜條件下，只改變流動(dòng)相的速度，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，流動(dòng)速度增大，保留時(shí)間就縮短。實(shí)驗(yàn)中通過(guò)調(diào)整流動(dòng)相比例與流動(dòng)速度，使其相匹配，產(chǎn)生的色譜峰分離效果好，色譜峰峰形穩(wěn)定、對(duì)稱，測(cè)得數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，實(shí)驗(yàn)中實(shí)際選用流動(dòng)相速度為1.0 mL/min。

HXDTM是由丹參等十多味藥材經(jīng)過(guò)水提工藝制得的，丹參是方中主藥之一，而水溶性成分丹參素和原兒茶醛是丹參中主要成分，因此，將丹參素和原兒茶醛作為含量考察指標(biāo)之一，建立了含量測(cè)定方法；但中藥復(fù)方制劑的藥效是多種化學(xué)成分共同作用的結(jié)果，單一一味藥中的一種或幾種成分含量的高低并不能全面反映中藥復(fù)方制劑的藥效，方中其他有效成分含量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)有待進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)中供試品經(jīng)簡(jiǎn)單處理后即可測(cè)定，方法簡(jiǎn)便、快速、重復(fù)性好、專屬性好，可用于HXDTM的質(zhì)量控制。

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