王喆等

摘 要：本文通過考察甜菜堿和EDTA二鈉鹽對(duì)PHB提取收率的影響，確定了甜菜堿和EDTA二鈉鹽在甲烷氧化混合菌胞內(nèi)PHB提取工藝中的最優(yōu)用量。

關(guān)鍵詞：PHB；甜菜堿；EDTA二鈉鹽

PHB以其生物降解性、生物相容性、壓電性、光學(xué)活性以及在生物合成過程中可利用再生資源等特性，在藥學(xué)、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)、電子等領(lǐng)域具有獨(dú)特而廣闊的應(yīng)用前景，但目前未能實(shí)現(xiàn)PHB的大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)[1，2]。本文通過考察甜菜堿和EDTA二鈉鹽對(duì)PHB提取收率的影響，確定甜菜堿和EDTA二鈉鹽在甲烷氧化混合菌胞內(nèi)PHB提取工藝中的最優(yōu)用量，提高收率，建立甲烷氧化混合菌胞內(nèi)PHB提取的新方法：表面活性劑（甜菜堿）-螯合物（EDTA二鈉鹽）提取法，探索簡單、無毒，無污染的新工藝提取PHB。

1 材料和方法

1.1 材料

混合菌群Methylococcus capsulatus HD6T從黑龍江省大慶油田富含沼氣地區(qū)的土壤中培養(yǎng)篩選獲得。

1.2 PHB的氯仿提取法

取發(fā)酵的菌液，4℃，9000r/min下離心10min，用蒸餾水洗滌2次，再次離心收集菌體，烘干至恒重。在菌體中加入濃度為80%甲醇水溶液攪拌， 60℃水浴1h。水浴后的菌體以轉(zhuǎn)速9000r/s，溫度4℃，離心15min。離心后收集細(xì)胞烘干。干細(xì)胞加入氯仿， 80℃水浴回流萃取1h。所得液體用分析濾紙進(jìn)行過濾，用氯仿洗3次，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到純化的PHB，用濃硫酸法測定含量。

1.3 濃硫酸法測定PHB含量

濃硫酸與PHB 100℃時(shí)水浴10min，濃硫酸與PHB在加熱時(shí)可以定量轉(zhuǎn)化為巴豆酸，巴豆酸在235nm處有一最大吸收峰值，通過紫外分光光度計(jì)測定OD235值確定PHB的量。

1.4 甜菜堿法提取PHB條件的優(yōu)化

表面活性劑甜菜堿（0.6-3mg），螯合物乙二胺四乙酸二鈉鹽即EDTA二鈉鹽（0-1mg），溶解于50ml去離子水中，用5mol/L的NaOH調(diào)節(jié)PH值至13，加入甲烷氧化混合菌干細(xì)胞，于50°C以1200rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行細(xì)胞破壁處理20min，將離心得到的沉淀物質(zhì)用去離子水和丙酮各洗滌一次，于70°C恒溫干燥箱內(nèi)烘干，純化的PHB用濃硫酸法測定含量。

以同一批培養(yǎng)的甲烷氧化混合菌干細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)材料，先通過較準(zhǔn)確的氯仿提取法提取PHB，再用甜菜堿法提取PHB，將甜菜堿法提取的PHB含量與氯仿法提取的PHB含量進(jìn)行比較，考察甜菜堿法提取PHB的收率，確定甜菜堿法最佳提取條件。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同的甜菜堿對(duì)細(xì)胞干重比對(duì)PHB提取量的影響

離心收集細(xì)胞，放于70°C恒溫干燥箱內(nèi)干燥，將干燥后的細(xì)胞在此條件下反應(yīng)：表面活性劑（甜菜堿）對(duì)細(xì)胞干重比分別為 0.03、0.06、0.1、0.15、0.2、0.3，螯合物（EDTA二鈉鹽）對(duì)干重比為0.1：1，加入去離子水，pH值調(diào)至13，于50°C下以1200rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行細(xì)胞破壁處理20min，將離心得到的沉淀物質(zhì)用去離子水和丙酮各洗滌一次，于70°C恒溫干燥箱內(nèi)烘干。將烘干后得到的PHB與濃硫酸在100°C下水浴10min， 再測定OD235值，計(jì)算出PHB的含量，與氯仿法提取PHB的含量做比較，計(jì)算出提取收率。當(dāng)表面活性劑（甜菜堿）對(duì)細(xì)胞干重比為0.09：1時(shí)，PHB的提取收率最大，為90.33%。

2.2 不同的EDTA二鈉鹽對(duì)細(xì)胞干重比對(duì)PHB提取量的影響

離心收集細(xì)胞，放于70°C恒溫干燥箱內(nèi)干燥，將干燥后的細(xì)胞在此條件下反應(yīng)：表面活性劑（甜菜堿）對(duì)細(xì)胞干重比為0.1：1，螯合物（EDTA二鈉鹽）對(duì)干重比分別為0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1，加入去離子水，pH值調(diào)至13，于50 ° C下以1200rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行細(xì)胞破壁處理20min，將離心得到的沉淀物質(zhì)用去離子水和丙酮各洗滌一次，于70°C恒溫干燥箱內(nèi)烘干。將烘干后得到的PHB與濃硫酸在100°C下水浴10min， 再測定OD235值，計(jì)算出PHB的含量，與氯仿法提取PHB的含量做比較，計(jì)算出提取收率。結(jié)果見圖1，當(dāng)螯合物（EDTA二鈉鹽）對(duì)干重比為0.08：1時(shí)，PHB的提取收率最大，為96.22%。

3 結(jié)論

通過用傳統(tǒng)的氯仿提取法提取出的PHB含量為基準(zhǔn)，采用 PHB含量相同的甲烷氧化混合菌干細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，以提取收率為指標(biāo)，優(yōu)化了甜菜堿-EDTA二鈉鹽的提取條件。當(dāng)表面活性劑（甜菜堿）對(duì)干重比為 0.1：1，螯合物（EDTA二鈉鹽）對(duì)干重比為0.08：1時(shí)，提取收率最高。以此優(yōu)化的甜菜堿和EDTA二鈉鹽用量，加入去離子水，pH值調(diào)至13，于50°C下以1200rpm的轉(zhuǎn)速進(jìn)行細(xì)胞破壁處理20min，將離心得到的沉淀物質(zhì)用去離子水和丙酮各洗滌一次，于70°C恒溫干燥箱內(nèi)烘干，得到了純化的PHB，從而建立了簡單、無毒，無污染的甲烷氧化混合菌胞內(nèi)PHB提取的新方法。

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