王飛 王妍 程律莎 謝木源 張麗君? 梁世中??

(1.華南理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510006;2.深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院 應(yīng)用化學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東 深圳518055;3.廣東藥學(xué)院 生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

疾病或創(chuàng)傷造成的骨缺損在臨床上十分常見(jiàn)，近年來(lái)，利用組織工程骨修復(fù)骨缺損的研究方興未艾［1-5］.聚乳酸-羥基乙酸/磷酸三鈣(Polylactic Glycolic Acid/Tricalcium Phosphate，PLGA/TCP)材料適應(yīng)快速成型制造，具有優(yōu)良的力學(xué)性能和化學(xué)穩(wěn)定性，其在生物體內(nèi)的降解產(chǎn)物乳酸可參與到新陳代謝中，最終生成二氧化碳和水排出體外，且其多孔的結(jié)構(gòu)可提供很大的表面積/體積比，適合應(yīng)用于骨組織工程［6-7］.

人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Human Marrow Mesenchymal Stem Cells，hMSCs)由于獲取途徑較為便捷，擴(kuò)增表型穩(wěn)定，同時(shí)避免了醫(yī)學(xué)倫理爭(zhēng)議，因而成為理想的組織工程骨種子細(xì)胞，用于向成骨細(xì)胞方向誘導(dǎo)以構(gòu)建組織工程骨.Tali 等［8］采用hMSCs 構(gòu)建軟骨，體外接種生物活性材料并植入裸鼠體內(nèi)，成軟骨效果理想.黃永輝等［9］采用hMSCs 和納米晶膠原骨構(gòu)建組織工程骨，體外培養(yǎng)后成骨現(xiàn)象良好.Kim 等［10］構(gòu)建了hMSCs 和預(yù)先礦化的絲支架結(jié)合的組織工程骨并進(jìn)行體外培養(yǎng)，結(jié)果顯示hMSCs在絲支架上增殖和成骨分化的效果明顯.

文中著重研究hMSCs 的成骨定向分化能力及與PLGA/TCP 的生物相容性，為后續(xù)利用hMSCs 和PLGA/TCP 構(gòu)建組織工程骨以應(yīng)用于動(dòng)物試驗(yàn)和臨床實(shí)驗(yàn)提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞株

第5 代的hMSCs 細(xì)胞株購(gòu)自賽業(yè)(廣州)生物科技有限公司.在37 ℃下于5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)箱中孵育至細(xì)胞鋪滿(mǎn)瓶底時(shí)，用0.25%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的胰蛋白酶消化傳代，于每4 天換液，每7 天傳代，至第8 代用于實(shí)驗(yàn).

1.1.2 主要試劑及儀器

主要試劑如下:低糖DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)、高糖DMEM、胎牛血清、胰蛋白酶、L-谷氨酸和雙抗均購(gòu)自Gibco 公司，抗壞血酸、β-甘油磷酸鈉和地塞米松均購(gòu)自Sigma 公司，四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司，VON KASSA 染色試劑盒、核固紅復(fù)染試劑盒和堿性磷酸酶(ALP)酶活性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司.

主要儀器如下:Hera Cell 240 型細(xì)胞培養(yǎng)箱，美國(guó)熱電公司生產(chǎn);Olympus CKX41 型倒置相差顯微成像系統(tǒng)，日本奧林巴斯公司生產(chǎn);蘇凈安泰BHC-1000ⅡA2 型生物安全柜，江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司生產(chǎn);Eppendorf 5810 R 型臺(tái)式離心機(jī)，德國(guó)艾本德公司生產(chǎn);Spectramax M5e 型多功能酶標(biāo)儀，美國(guó)Molecular Devices 公司生產(chǎn);Quanta 450 型掃描電鏡，美國(guó)FEI 公司生產(chǎn).

1.1.3 hMSCs 的完全和成骨分化培養(yǎng)基

hMSCs 的完全培養(yǎng)基包括如下成分:低糖DMEM 88%，胎牛血清10%，L-谷氨酸1%，青/鏈霉素1%.以上成分含量均為體積分?jǐn)?shù).

hMSCs 的成骨分化培養(yǎng)基包括如下成分:高糖DMEM 86.5%，胎牛血清10%，L-谷氨酸1%，青/鏈霉素1%，10 mmol/L 抗壞血酸0.5%，1 mol/L β-甘油磷酸鈉1%，1mmol/L 地塞米松0.01%.以上成分含量均為體積分?jǐn)?shù).

1.1.4 PLGA/TCP 的預(yù)處理

PLGA/TCP 由清華大學(xué)機(jī)械工程系提供，材料通過(guò)Ⅰ型膠原進(jìn)行處理以利于細(xì)胞的附著生長(zhǎng).在無(wú)菌環(huán)境下將材料切割成4 mm ×4 mm ×2 mm 的小塊.提前準(zhǔn)備好滅菌的平皿，將切割好的材料放入平皿中，紫外線(xiàn)照射30 min;然后將材料轉(zhuǎn)入滅菌的燒杯，用75%酒精完全浸沒(méi)材料，浸泡30 min 滅菌并提高材料的親水性.吸出酒精，用磷酸鹽緩沖溶液(PBS)清洗3 次后浸泡過(guò)夜，以盡可能除去殘存的乙醇.

接種細(xì)胞前將材料在培養(yǎng)基中浸泡24 h，取出后以無(wú)菌濾紙吸干水分.

1.2 實(shí)驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)方法

1.2.1 hMSCs 在平面上的接種和換液

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第8 代hMSCs，以完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1 ×105個(gè)/mL.6 孔板每孔接種200 μL 細(xì)胞懸液，補(bǔ)充培養(yǎng)基至3 mL.細(xì)胞分為對(duì)照組和成骨組，4 天時(shí)用完全培養(yǎng)基和成骨分化培養(yǎng)基對(duì)應(yīng)換液，之后每3 天換液.

1.2.2 hMSCs 在平面上成骨分化的VON KASSA染色檢測(cè)

hMSCs 接種于6 孔板21 天后，小心抽去孔里的培養(yǎng)基，加入清理液清洗，用固定液固定10 min 后清洗2 次，染色1 h，再用清理液孵育2 min，平衡液孵育5 min，繼續(xù)用清理液孵育2 min，核固紅復(fù)染后于倒置顯微鏡下觀(guān)察拍照，每組3 個(gè)復(fù)孔.

1.2.3 hMSCs 在平面上成骨分化的ALP 酶活性檢測(cè)

hMSCs 接種于6 孔板后的第3、6、9、12、15、18和21 天，分別取一塊6 孔板，吸盡液體，用清理液沖洗和0.25%胰蛋白酶消化，用吸管輕輕吹打數(shù)次，再加入含血清培養(yǎng)基終止消化，離心收集細(xì)胞，加入300 μL 裂解液，4 ℃下孵育30 min，13000 r/min 下離心5 min，移取上清，進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)后，取5 μL上清加入220 μL 緩沖液和25 μL ALP 反應(yīng)液，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上以405 nm 波長(zhǎng)測(cè)定各孔0 和5 min的光密度(OD)值，每組3 個(gè)復(fù)孔，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.

1.2.4 hMSCs 在PLGA/TCP 上的接種和換液

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第8 代hMSCs，以完全培養(yǎng)基重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度至1 ×104個(gè)/mL.

將經(jīng)過(guò)預(yù)處理的PLGA/TCP 置于96 孔板中，用1 mL 的注射器取100 μL 細(xì)胞懸液逐滴地滴加到材料表面并下滲，3 min 后將材料翻轉(zhuǎn)，以同樣的方式滴加到另一面，靜置15 min 后置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 天換液，進(jìn)行成骨分化的材料/細(xì)胞復(fù)合物在接種后4 天用成骨分化培養(yǎng)基換液.

1.2.5 hMSCs 在PLGA/TCP 上增殖和成骨分化的電鏡檢測(cè)

hMSCs 接種于PLGA/TCP 1、3、5、7 天后，分別取1 塊材料，用PBS 清洗以去除未貼壁的細(xì)胞，再經(jīng)3%戊二醛固定，乙醇系列脫水，臨界點(diǎn)干燥，噴金，用掃描電鏡觀(guān)察hMSCs 在PLGA/TCP 上的黏附增殖情況.

材料/細(xì)胞復(fù)合物用成骨分化培養(yǎng)基換液7 天后，取1 塊材料，用掃描電鏡觀(guān)察hMSCs 在PLGA/TCP 上的成骨分化情況.

1.2.6 hMSCs 在PLGA/TCP 上增殖的MTT 檢測(cè)

hMSCs 接種于PLGA/TCP 1、3、5、7 天后，分別取一塊96 孔板，每孔加入5 g/L 的MTT 溶液10 μL，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，每孔再加入100 μL 的Formanzan 溶解液，在培養(yǎng)箱內(nèi)再繼續(xù)孵育4h，直至在普通光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察發(fā)現(xiàn)Formanzan 全部溶解.在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上以570nm 波長(zhǎng)測(cè)定各孔的OD 值，每組6 個(gè)復(fù)孔，以hMSCs 直接接種于孔板底部作為對(duì)照，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次.

1.2.7 hMSCs 在PLGA/TCP 上成骨分化的ALP 酶活性檢測(cè)

材料/細(xì)胞復(fù)合物用成骨分化培養(yǎng)基換液1、3、5、7 天后，分別取一塊96 孔板，吸盡液體，用清理液沖洗和0.25%胰蛋白酶消化，并用吸管輕輕吹打數(shù)次，再加入含血清培養(yǎng)液終止消化，離心收集細(xì)胞，加入100 μL 裂解液，4 ℃下孵育30 min，13000 r/min 下離心5 min，移取上清，進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)后，取5 μL上清加入220 μL 緩沖液和25 μL ALP 反應(yīng)液，每組6個(gè)復(fù)孔，以hMSCs 直接接種于孔板底部作為對(duì)照，結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析.以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)2 次.

1.2.8 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以“算術(shù)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示，進(jìn)行t 檢驗(yàn)，若P ＜0.05 則認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果與討論

2.1 hMSCs 的成骨定向分化結(jié)果

2.1.1 hMSCs 在平面上成骨分化的VON KASSA染色結(jié)果

VON KASSA 染色結(jié)果(見(jiàn)圖1)顯示:對(duì)照組細(xì)胞增殖呈長(zhǎng)梭形成纖維細(xì)胞樣，細(xì)胞排列密集，呈漩渦狀，未發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的重疊及鈣結(jié)節(jié)的形成;成骨組細(xì)胞逐漸集中，呈鋪路石狀，隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，局部細(xì)胞呈重疊生長(zhǎng)，逐漸堆積，礦鹽沉積，形成多個(gè)黑色的鈣結(jié)節(jié).

圖1 6 孔板上hMSCs 成骨分化的VON KASSA 染色結(jié)果Fig.1 VON KASSA photos of osteogenic differentiation of hMSCs on 6-well plate

2.1.2 成骨分化標(biāo)志物的ALP 酶活性檢測(cè)結(jié)果

ALP 酶活性是細(xì)胞成骨分化水平的重要標(biāo)志，ALP 酶活性檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)圖2)顯示:成骨組在換用成骨分化培養(yǎng)基后3 天已與對(duì)照組有顯著性差異(P ＜0.01);分化初期A(yíng)LP 酶活性隨時(shí)間不斷增高，12 天后達(dá)到最高值，15 天后略有下降，之后進(jìn)入一個(gè)平臺(tái)期;對(duì)照組細(xì)胞隨時(shí)間延長(zhǎng)其ALP 酶活性也略有上升，但增幅明顯小于成骨組.

圖2 hMSCs 在6 孔板上成骨分化的ALP 酶活性檢測(cè)Fig.2 ALP test results of osteogenic differentiation of hMSCs on 6-well plate

2.2 hMSCs 與PLGA/TCP 的相容性結(jié)果

2.2.1 hMSCs 在PLGA/TCP 上增殖的檢測(cè)結(jié)果

電鏡下觀(guān)察到:未接種細(xì)胞的空白材料其多孔結(jié)構(gòu)非常明顯，孔與孔之間結(jié)構(gòu)致密，見(jiàn)圖3(a);接種(增殖)后1 天，細(xì)胞呈梭形附著在材料上，見(jiàn)圖3(b);接種后3 天，細(xì)胞表面生長(zhǎng)大量微絨毛，表明細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞間彼此相連，見(jiàn)圖3(c);接種后5 天，細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞外基質(zhì)開(kāi)始形成薄層均勻分布在材料上，基質(zhì)層上可見(jiàn)小球狀顆粒，見(jiàn)圖3(d);接種后7 天，細(xì)胞已長(zhǎng)入支架孔中，細(xì)胞間有大量微絲相連，見(jiàn)圖3(e).

圖3 hMSCs 在PLGA/TCP 上增殖的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.3 SEM photos of hMSCs proliferation on PLGA/TCP

MTT 檢測(cè)結(jié)果(見(jiàn)表1)顯示:與平面培養(yǎng)相對(duì)照，hMSCs 在PLGA/TCP 上的增殖速度較快，增殖效果更為明顯.增殖1 和3 天，材料上hMSCs 和平面對(duì)照組的增殖速度較為接近，兩者的OD 值沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05);增殖5 和7 天，材料上hMSCs的增殖速度明顯高于平面對(duì)照組，兩者的OD 值有顯著性差異(P ＜0.01).分析認(rèn)為，平面對(duì)照hMSCs在3～5 天之間處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，隨后在7 d 進(jìn)入生長(zhǎng)相對(duì)緩慢的平臺(tái)期，而在材料上生長(zhǎng)的hMSCs 在7 d 仍然具有較高的增殖速度，究其原因，應(yīng)與PLGA/TCP的多孔結(jié)構(gòu)具有很大的表面積/體積比，使得細(xì)胞有更多的空間可以粘附和生長(zhǎng)有關(guān).

表1 hMSCs 在PLGA/TCP 材料上增殖的MTT 檢測(cè)結(jié)果1)Table 1 MTT test results of hMSCs proliferati on on PLGA/TCP

2.2.2 hMSCs 在PLGA/TCP 上的成骨分化效果

掃描電鏡下觀(guān)察到，用成骨分化培養(yǎng)基換液7天后，細(xì)胞基質(zhì)層已覆蓋材料表面積的60%以上，隱約可見(jiàn)鈣結(jié)節(jié)，見(jiàn)圖4.

ALP 酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，在PLGA/TCP 上成骨分化的hMSCs，其ALP 酶活性要高于平面對(duì)照組，這意味著材料能促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化.分化第1 天，材料和平面對(duì)照組的ALP 酶活性較為接近，兩者沒(méi)有顯著性差異(P＞0.05);分化第3 天，材料上hMSCs 的ALP 酶活性已高于平面對(duì)照組，兩者有顯著性差異(P ＜0.05)，到第5 和第7 天，兩者差異更為顯著(P ＜0.01)，見(jiàn)圖5.

圖4 hMSCs 在PLGA/TCP 上成骨分化7d 的掃描電鏡照片F(xiàn)ig.4 SEM photo of osteogenic differentiation of hMSCs on PLGA/TCP for 7 days

圖5 hMSCs 在材料和平面對(duì)照上的成骨分化趨勢(shì)比較Fig.5 Comparison of osteogenic differentiation between hMSCson PLGA/TCP and the control

3 結(jié)語(yǔ)

目前，骨組織工程的研究主要集中在以下4 個(gè)方面:種子細(xì)胞，支架材料，骨生長(zhǎng)因子和臨床應(yīng)用［11-12］.文中從支架材料和種子細(xì)胞兩個(gè)方面著手，重點(diǎn)考察了hMSCs 作為種子細(xì)胞與PLGA/TCP結(jié)合的生物相容性.

文中研究表明，hMSCs 作為種子細(xì)胞具有很強(qiáng)的成骨分化能力，接種于平面上的hMSCs 在成骨分化21 天時(shí)已經(jīng)具有典型的骨細(xì)胞形態(tài)，鈣結(jié)節(jié)明顯，ALP 酶活性則明顯高于空白對(duì)照組，前12 天大幅上升，隨后逐漸進(jìn)入平臺(tái)期.

接種于PLGA/TCP 上的hMSCs 展現(xiàn)了與材料良好的生物相容性.電鏡結(jié)果顯示，細(xì)胞充分利用了材料的多孔特性，在材料上的增殖和分化有別于平面對(duì)照組，且其增殖能力明顯好于平面對(duì)照組.MTT 檢測(cè)顯示，在接種初期，兩者比較接近，5 天后平面對(duì)照組的細(xì)胞受到接觸抑制而轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)緩慢的平臺(tái)期，而材料上生長(zhǎng)的細(xì)胞仍具有較高的增殖速度，這表明PLGA/TCP 較大的表面積/體積比能支持更多的細(xì)胞生長(zhǎng).同樣，在PLGA/TCP 上進(jìn)行成骨分化的細(xì)胞，其分化效果也高于平面對(duì)照組，ALP 酶活性檢測(cè)顯示，分化初期兩者具有相同的ALP 酶活性，3 天時(shí)立體培養(yǎng)組的ALP 酶活性逐漸超越對(duì)照組，5 天時(shí)開(kāi)始有更顯著的差異.

通過(guò)驗(yàn)證PLGA/TCP 與種子細(xì)胞hMSCs 的良好的生物相容性，文中研究為兩者結(jié)合生成組織工程骨并進(jìn)行動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定了良好的基礎(chǔ).

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