徐惠娟 梁翠誼 許敬亮 郭穎 張宇 莊新姝 袁振宏?

(1.中國科學院 廣州能源研究所∥可再生能源重點實驗室，廣東 廣州 510640;2.中國科學院大學，北京100049)

自1987年發(fā)現(xiàn)第一株可以利用CO 或CO2、H2進行生長并發(fā)酵產乙醇的微生物Clostridium ljungdahlii(C.ljungdahlii)之后，一種新的乙醇生產技術——合成氣發(fā)酵應運而生.該技術以煤、生物質或有機廢棄物的氣化合成氣(主要成分為CO、CO2和H2)為原料，利用特定的微生物將其發(fā)酵為乙醇.由于氣化過程可以將原料中的所有含碳有機物轉化為合成氣，因此包括木質素在內的一些難降解物質都可以被利用;而且合成氣生物轉化具有反應條件溫和、專一性強及對合成氣中的某些毒害氣體具耐受性等優(yōu)點［1-2］.除氣化合成氣外，一些富CO 的工業(yè)廢氣(如轉爐氣、電石爐氣、黃磷爐氣等)也可以被合成氣發(fā)酵微生物利用及轉化.

C.ljungdahlii 是最早被研究也是研究得最多的合成氣乙醇發(fā)酵菌株［3-7］，此后，研究者們又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了其他的一些合成氣發(fā)酵菌株，包括Clostridium carboxidivorans(C.carboxidivorans)［8-9］、Clostridium autoethanogenum(C.autoethanogenum)［10］、Clostridium ragsdalei(C.ragsdalei)［11-12］及Alkalibaculum bacchi(A.bacchi)［13］等.這些菌株產乙醇的能力各不相同.據報道，C.ljungdahlii 在具細胞循環(huán)的連續(xù)攪拌罐式反應器(CSTR)中發(fā)酵，乙醇的質量濃度高達48 g/L［14］;C.carboxidivorans 在 鼓 泡 柱 式 反 應 器(BCR)中發(fā)酵13 d 后，乙醇質量濃度達2.75 g/L［15］;同樣在具細胞循環(huán)的CSTR 中，A.bacchi 連續(xù)發(fā)酵30 d 后的乙醇質量濃度達5 g/L 以上［16］.相較之下，C.autoethanogenum 的相關研究較少，而且在僅有的一些報道中，其合成氣發(fā)酵的乙醇質量濃度都在0.5 g/L 以下［17-18］.合成氣發(fā)酵菌株基本都是嚴格厭氧菌，因而通常采用厭氧瓶或血清瓶對它們進行批式發(fā)酵研究，下層液相為培養(yǎng)基和菌體，氣體底物充滿上層空間.但是對于一個氣體底物發(fā)酵過程而言，這兩種容器都存在一定缺陷:由于底物處于固定體積的上層氣相中，隨著底物的利用，上層氣相的壓力會逐漸降低，不利于底物的進一步利用，而且這種體積固定的玻璃瓶不便于監(jiān)測、計量氣體的利用情況.有鑒于此，文中擬采用一種新的反應容器來研究合成氣發(fā)酵過程，克服厭氧瓶或血清瓶的上述缺陷.

C.autoethanogenum 可以利用木糖，且木糖是其生長的優(yōu)良底物.木質纖維素原料水解液中的一個重要組分即是木糖，但這部分木糖較難被發(fā)酵利用.因此，文中擬以C.autoethanogenum 為研究對象，考察其對木質纖維素水解液的利用及CO 發(fā)酵性能，探索氣體發(fā)酵制乙醇的新工藝.

1 材料與方法

1.1 菌株與培養(yǎng)基

所用菌株C.autoethanogenum DSM 10061 購自德國菌種保藏中心.

生長培養(yǎng)基在DSMZ640 培養(yǎng)基［18］和Rajagopalan 培養(yǎng)基［19］的基礎上進行了改良，成分(每升)如下:10 mL 無機鹽溶液，10 mL 微量元素溶液，10 mL維生素溶液，1.0 g 酵母膏，2.0 g 蛋白胨，0.5 g 半胱氨酸鹽酸，5.0 g 嗎啉乙磺酸，0.5 mL 0.1%刃天青，5.0 g 木糖，pH=6.其中，無機鹽溶液組成如下:NaCl 80 g/L，NH4Cl 100 g/L，KCl 10 g/L，KH2PO410 g/L，MgSO4·7H2O 20 g/L，CaCl2·2H2O 4 g/L;微量元素溶液組成如下:次氮基三乙酸2 g/L，MnCl2·4H2O 1.3 g/L，CoCl2·6H2O 0.2 g/L，ZnSO4·7H2O 0.2 g/L，F(xiàn)eCl3·6H2O 0.4 g/L，CuCl2·2H2O 0.02 g/L，NiCl2·6H2O 0.02 g/L，Na2MoO4·2H2O 0.02 g/L，Na2WO4·2H2O 0.025 g/L;維生素溶液組成如下:生物素2 mg/L，葉酸2 mg/L，維生素B610 mg/L，維生素B15 mg/L，核黃素5 mg/L，煙酸5 mg/L，泛酸鈣5 mg/L，維生素B125 mg/L，對氨基苯甲酸5 mg/L.

發(fā)酵培養(yǎng)基不含木糖和蛋白胨，其余組分同生長培養(yǎng)基，pH=6.

配制好的培養(yǎng)基于121 ℃下高壓蒸汽滅菌20 min后，從滅菌鍋中取出，立即放入厭氧操作箱中(氣氛組成:N285%，H210%，CO25%)，待培養(yǎng)基顯示無色后加塞密封.所有接種及取樣等操作均在厭氧箱中進行.

1.2 分析方法

發(fā)酵液于4 ℃、12000 r/min 下離心10 min，取上清.乙醇與乙酸含量采用Agilent 7890A 型氣相色譜儀檢測，載氣為Ar，采用DB-FFAP 毛細柱(30 m ×0.25 mm×0.25 μm)和FID 檢測器，進樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為300 ℃.色譜柱先在40 ℃下保持5 min;然后以20 ℃/min 的速度升溫至140 ℃，保持3 min;繼續(xù)以40 ℃/min 的速度升溫至250 ℃，再保持3 min.柱流量為1 mL/min，載氣流率為30 mL/min，分流比為l∶50.

發(fā)酵液中殘?zhí)羌八庖旱某煞植捎肳aters2498高效液相色譜儀(HPLC)檢測，Shodex Sugar SH1011柱，以0.005 mol/L 的H2SO4作為流動相，流量為0.5 mL/min，柱溫為50 ℃，UV-RI 檢測器，檢測器溫度為50℃.樣品需預先離心(12000r/min，10min)并以0.22 μm 濾膜過濾.

氣體組分檢測采用Agilent 7890A 型氣相色譜儀，Agilent 5A 分子篩柱(8ft ×1/8″ ×2 mm，60～80目)和Agilent Hayesep Q 柱(6ft ×1/8″ ×2 mm，80～100 目)，進樣器溫度為200 ℃，分流比為20 ∶1，柱流量為3 mL/min，TCD 檢測器溫度為200 ℃.柱子先在60 ℃下保持3 min，再以15 ℃/min 的速率升溫到250 ℃.

通過檢測600 nm 波長下菌液的光密度(OD)值來測量菌體密度，再根據OD 值與干重的計量關系計算得到細胞干重.前期研究已知每一個OD600對應的細胞干重為247 mg/L.

1.3 碳源對C.autoethanogenum 生長影響的檢測

分別以葡萄糖和纖維二糖代替生長培養(yǎng)基中的木糖，保持質量濃度不變(5.0 g/L)，配制成相應的培養(yǎng)基，按10%的接種量接種活化后的C.autoethanogenum 至不同培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)4 d，取樣檢測OD600值及糖含量.在100 mL厭氧瓶中進行反應，培養(yǎng)基為50 mL.

1.4 C.autoethanogenum 生長曲線的測定

反應在500mL 厭氧瓶中進行.按10%的接種量接種活化后的C.autoethanogenum 至生長培養(yǎng)基中，37 ℃下靜置培養(yǎng)，定時取樣檢測OD600值、殘?zhí)羌爱a物質量濃度.

1.5 氣袋生長-發(fā)酵實驗

反應在1 L 鋁箔氣體采樣袋(簡稱氣袋，大連德霖氣體包裝有限公司生產)中進行.氣袋預先以N2充放氣3 次，再以CO 充放氣3 次，然后在壓力為0.015 MPa、流量為0.8 L/min 的條件下充氣(CO)1 min，關閉旋塞.按10%的接種量接種生長至對數(shù)期的C.autoethanogenum 于發(fā)酵培養(yǎng)基中，混勻后用注射器抽取樣品，從旋塞上的小孔注入氣袋中，每個氣袋加入55 mL.氣袋置于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，待氣袋完全扁下去后取樣檢測殘留氣體成分、OD600值及產物質量濃度.隨后，按上述條件再次向氣袋充氣(CO)，重新灌充CO 的氣袋繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待氣袋再次完全扁下去后同上進行第二次檢測.

CO 乙醇轉化率根據下式計算:

1.6 C.autoethanogenum 對蔗渣水解液的利用實驗

甘蔗渣粉碎至40～80 目，水洗后于105 ℃下烘干，以1∶20 的質量比與水混合，置于水解反應器中進行水解，水解液冷卻后于12 000 r/min 下離心10 min，取上清.以水解液離心后的上清代替生長培養(yǎng)基中的木糖及水，配制成水解液培養(yǎng)基(pH=6).按10%的接種量接種生長至對數(shù)期的C.autoethanogenum 于水解液培養(yǎng)基中，在37 ℃下靜置培養(yǎng)4 d，取樣檢測OD600值、殘?zhí)羌爱a物質量濃度.反應在100 mL 厭氧瓶中進行，培養(yǎng)基為50 mL.

2 結果與討論

2.1 碳源對C.autoethanogenum 生長的影響

德國菌種保藏中心推薦的C.autoethanogenum生長培養(yǎng)基中既含木糖，又含纖維二糖，而Abrini等［10］認為C.autoethanogenum 不能利用葡萄糖.文中分別以木糖、葡萄糖和纖維二糖為唯一碳源配制生長培養(yǎng)基，考察C.autoethanogenum 對不同碳源的利用情況，結果如圖1 所示.從圖中可以看出:以木糖為碳源時C.autoethanogenum 生長最好，菌體質量濃度及糖利用率都遠遠高于其他兩種碳源;C.autoethanogenum 在葡萄糖及纖維二糖培養(yǎng)基中都有少量生長，但是糖利用率都較低(小于10%)，其中對纖維二糖的利用最少.這說明葡萄糖和纖維二糖都不適宜作為C.autoethanogenum 生長培養(yǎng)基的碳源，因此后續(xù)研究中均以木糖為生長培養(yǎng)基中的唯一碳源.

圖1 C.autoethanogenum 對不同碳源的利用Fig.1 Utilization of different carbon sources by C.autoethanogenum

2.2 C.autoethanogenum 在改良培養(yǎng)基中的生長曲線

圖2 為C.autoethanogenum 在改良培養(yǎng)基中的生長曲線.從圖中可以看出:第1 天為生長延滯期;從第2 天開始，C.autoethanogenum 進入對數(shù)生長期;第4 天后進入穩(wěn)定期.菌株生長的同時伴隨著木糖的消耗及乙酸的生成，而乙醇只在對數(shù)生長中期才開始被檢測到，且量很少(小于0.25 g/L)，整個生長階段變化不大，說明乙酸是生長偶聯(lián)型產物，而乙醇是非生長偶聯(lián)型產物，這與Klasson 等［20］對C.ljungdahlii 的研究結果一致.因為乙醇和乙酸是由中間代謝物乙酰輔酶A 在不同酶的催化下轉化而成的，生成乙酸能產生一分子ATP(三磷酸腺苷)，生成乙醇則不能，因此菌體生長階段的主要產物是乙酸.此外，在改良培養(yǎng)基中培養(yǎng)4 d 后，C.autoethanogenum 的菌體質量濃度可達311 mg/L，是之前郭穎等［21］研究結果的3 倍多.

圖2 C.autoethanogenum 的生長曲線Fig.2 Growth curves of C.autoethanogenum

2.3 氣袋生長-發(fā)酵實驗結果及分析

CO 發(fā)酵是一個厭氧氣態(tài)底物發(fā)酵過程，反應式如下所示:

該過程對反應裝置的密封性能要求比較高，普通的厭氧瓶較難滿足這一點.這是因為，注入瓶中的CO 可能從瓶口泄漏，而且CO 被利用后會使得瓶內上層氣相壓力降低，存在氧氣滲入的可能.文中采用密封性能良好的氣體采樣袋來研究C.autoethanogenum 的CO 發(fā)酵性能，反應前后的氣袋變化如圖3 所示.由于氣袋具有彈性體積，隨著CO 逐步被C.autoethanogenum 利用，氣袋的體積會逐漸縮小，這既便于觀察又使得上層氣相的壓力相對穩(wěn)定.雖然發(fā)酵過程中會產生一定的CO2，但一方面消耗的CO 摩爾數(shù)多于生成的CO2摩爾數(shù)，且C.autoethanogenum 可以繼續(xù)利用CO2(在一定還原力存在下)，另一方面CO2較易溶于水，所以最終氣袋里的氣體基本能耗盡.

圖3 氣袋變化圖Fig.3 Variation of gas sampling bag

表1 為C.autoethanogenum 的氣袋生長-發(fā)酵結果.發(fā)酵培養(yǎng)基中的酵母膏質量濃度分別為0.8和1.0 g/L，整個生長-發(fā)酵過程進行了兩次CO 充氣操作，每一階段耗時20 d 左右，最后檢測氣袋中的余氣只有CO2，沒有CO.從表1可以看出:在第1階段，消耗的CO 主要用于菌體生長，菌體質量濃度得到較大增長，產物以乙酸為主，醇酸摩爾比較低，CO 乙醇轉化率也較低(小于16%);在第2 階段，消耗的CO 有一部分仍用于菌體生長，表現(xiàn)為菌體質量濃度繼續(xù)增加，但是更多的CO 用于合成代謝物乙醇，乙酸質量濃度相比第1 階段有所降低，乙醇質量濃度則顯著提高;在1.0 g/L 酵母膏的發(fā)酵培養(yǎng)基中，乙醇質量濃度達到3.464 g/L，CO 乙醇轉化率達51.7%.另外，0.8 和1.0 g/L 酵母膏質量濃度下得到的最終菌體質量濃度基本相同，但是后者的乙醇和乙酸質量濃度更高，尤其是乙酸.酵母膏作為培養(yǎng)基中的主要氮源供菌體生長利用，較高的濃度有利于生長，而乙酸是生長過程中的主要代謝物，因此表現(xiàn)為產乙酸較多.但第2 階段的乙酸質量濃度均出現(xiàn)不同程度的降低，酵母膏質量濃度為0.8 g/L 時更為明顯，乙酸質量濃度降至0.252 g/L，使得最終醇酸摩爾比達到15.76，比酵母膏質量濃度為1.0 g/L 時的結果高很多.Klasson 等［20］在研究C.ljungdahlii 時也發(fā)現(xiàn)降低酵母膏濃度可以提高產物中的醇酸摩爾比.由乙醇和乙酸的代謝途徑得知，乙酸在乙醛氧化還原酶的催化下可轉化為乙醛，進一步可繼續(xù)轉化為乙醇，因而可以認為，第2階段乙醇質量濃度的增加伴隨著乙酸質量濃度的降低，說明可能有部分乙酸轉化為了乙醇.因此在一定范圍內，較高的酵母膏濃度或許是有利的，雖然醇酸比有所降低，但可以獲得更高的乙醇濃度，正如表1 的結果所示.關于這一點，筆者將在后續(xù)研究中展開更深入的探討.

表1 C.autoethanogenum 的氣袋生長-發(fā)酵結果Table 1 Results of growth and fermentation of C.autoethanogenum in gas sampling bag

2.4 C.autoethanogenum 對蔗渣水解液的利用

高溫液態(tài)水法是針對木質纖維素類生物質的一種綠色預處理方法，它可將木質纖維素中的半纖維素水解為木糖及其低聚糖，而且經高溫液態(tài)水處理后的纖維素原料更易于后續(xù)的酶解.該方法具有不添加化學試劑、發(fā)酵毒性副產物少等優(yōu)點［22-23］，缺點是水解液中得到的木糖濃度不高，如果用于木糖發(fā)酵過程需要先進行濃縮.水解過程中產生的副產物主要包括少量的糠醛、5-羥甲基糠醛、葡萄糖醛酸、乙醇酸、甲酸等，通常認為糠醛和5-羥甲基糠醛是發(fā)酵的主要抑制物，因此文中主要考察了這兩種物質對C.autoethanogenum生長的影響.表2 為C.autoethanogenum 在不同水解液培養(yǎng)基中的生長情況及產物，水解液由不同條件的高溫液態(tài)水處理蔗渣得到.從表2 可看出:雖然水解液中木糖的質量濃度較低，但仍可用于C.autoethanogenum 的生長;不過，隨著5-羥甲基糠醛及糠醛質量濃度的升高，菌體質量濃度降低，說明這兩種物質對菌株的生長有一定的抑制作用.經比較，N2環(huán)境下180 ℃、4 MPa處理20 min 得到的水解液較適合C.autoethanogenum 的培養(yǎng)，該條件正好也是蔗渣酶解預處理的一個較優(yōu)條件.

以上述條件處理蔗渣，將得到的水解液與其他營養(yǎng)物質混合制備水解液培養(yǎng)基，接種C.autoethanogenum，在厭氧瓶中培養(yǎng)2 d 后直接將培養(yǎng)液轉入已灌注CO 的1 L 氣袋進行氣袋發(fā)酵實驗.發(fā)酵14 d后氣袋體積大幅度減小，檢測發(fā)現(xiàn)上層氣相中的CO已耗盡，取樣分析發(fā)酵液的OD600及產物質量濃度等，結果如表3 所示.從表3 可以看出，經過兩天的培養(yǎng)，水解液培養(yǎng)基中的木糖已經用完，菌體質量濃度達142.1mg/L，產物中含少量乙醇.培養(yǎng)液接入氣袋后，CO 成為唯一的碳源，用于生長與代謝，表現(xiàn)為菌體質量濃度繼續(xù)增加，乙醇質量濃度達到3.13 g/L.由于仍有部分CO 用于菌體的生長，最終的CO 乙醇轉化率為46.9%.與表1 的結果相比較，利用蔗渣水解液生長后再進行CO 發(fā)酵，得到的乙醇質量濃度及轉化率可達到單純CO 生長-發(fā)酵中兩次發(fā)酵的水平，說明該工藝是可行的，而且具有如下優(yōu)點:①發(fā)酵時間大大縮短，由原來的40 d 左右減少到16 d;②更多的CO 被用于乙醇轉化;③將木質纖維素水解液中木糖的利用與CO 發(fā)酵有機結合了起來.

表2 C.autoethanogenum 在不同水解液培養(yǎng)基中的生長情況及產物Table 2 Growth and products of C.autoethanogenum in different hydrolysate media

表3 C.autoethanogenum 在蔗渣水解液中的生長情況及CO 發(fā)酵結果Table 3 Growth and CO fermentation results of C.autoethanogenum in bagasse hydrolysate medium

3 結論

通過考察C.autoethanogenum 對木質纖維素水解液的利用以及它的生長與CO 發(fā)酵性能，得到以下結論:

(1)木糖是C.autoethanogenum 生長的適宜碳源，但不適于乙醇合成，代謝產物以乙酸為主.C.autoethanogenum 在改良培養(yǎng)基中生長良好，菌體質量濃度較之前的研究結果提高兩倍以上.

(2)由于具有彈性體積及良好的氣密性能，氣袋非常適合用于氣體發(fā)酵的研究.C.autoethanogenum 能夠以100% CO 為唯一碳源進行生長并合成乙醇，雖然生長速度比以木糖為碳源時慢，但是產物中的乙醇質量濃度大大提高，在1 L 氣袋中經過兩次CO 發(fā)酵，乙醇質量濃度達3.464 g/L，CO 乙醇轉化率達51.7%.

(3)N2環(huán)境、180 ℃、4 MPa 下，20 min 高溫液態(tài)水處理蔗渣得到的水解液可用于C.autoethanogenum 的培養(yǎng)，再偶聯(lián)CO 發(fā)酵，該工藝的發(fā)酵結果可達到單純CO 生長-發(fā)酵時兩次發(fā)酵的水平，而且發(fā)酵時間大大縮短，CO 轉化為乙醇的效率提高.

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