官福新，周露露，張宸豪，李 妍* (吉林醫(yī)藥學(xué)院：.藥學(xué)院0級藥學(xué)本班，.藥學(xué)院00級藥學(xué)本班，.檢驗學(xué)院，吉林 吉林 0)

線粒體是細胞內(nèi)能量代謝的重要細胞器，是決定生存的控制中心。在細胞生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)、腫瘤學(xué)等研究領(lǐng)域，均需要通過檢測細胞線粒體功能而開展研究或輔助診斷疾病[1]。粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)變化可反應(yīng)線粒體功能的變化，有必要建立和優(yōu)化簡單、敏感和快速檢測MMP的方法[2]。本研究采用碳酰氰基-對-氯苯腙(carbonyl cyano-to-chlorobenzene hydrazone，CCCP)來損傷線粒體功能，分別裝載常用熒光探針Rh123和新型探針JC-1進行，流式細胞術(shù)分析CCCP損傷細胞后MMP的變化，探索檢測過程中的注意事項，建立更為穩(wěn)定和敏感的MMP分析方法。

1 材料與方法

1.1 材 料

人臍靜脈內(nèi)皮細胞ECV304保存于液氮中。熒光探針JC-1和Rh123購自上海碧云天生物技術(shù)研究所；1640培養(yǎng)液購自Gibco公司；小牛血清購自Hyclone公司；胰蛋白酶和EDTA為Sigma公司產(chǎn)品。流式細胞儀型號為Epics XL(美國貝克曼公司)。

1.2 細胞培養(yǎng)和傳代

實驗前1周復(fù)蘇ECV-304細胞，含10%小牛血清1640培養(yǎng)液、5%CO2、飽和濕度和37℃條件下培養(yǎng)。含0.5%胰蛋白酶0.2%EDTA的消化液消化細胞，2～3 d傳代1次，取對數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.3 CCCP處理細胞

調(diào)細胞密度為105/mL,按每瓶10 mL接種于75 mL培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)24 h。加入CCCP儲存液至終濃度分別為0、0.1、1和10 μmol/L,處理細胞20 min后，消化收集細胞，PBS洗2次。

1.4 裝載探針和流式細胞術(shù)分析

每組取5×105個細胞，按如下方法裝載Rh123探針并用流式細胞術(shù)分析：按說明書(產(chǎn)品編號C2006)方法配制JC-1染色工作液和染色緩沖液(冰沐)；500 μL JC-1染色工作液懸細胞，37 ℃條件下反應(yīng)30 min；離心吸棄上清，用冰沐的染色緩沖液洗滌細胞2次；500 μL染色緩沖液重懸細胞，用流式細胞儀FL1通道(525 nm)的檢測細胞發(fā)射的熒光。每組取5×105個細胞，按如下方法裝載Rh123探針和流式細胞術(shù)分析：將細胞懸浮于500 μmol PBS，加入Rh123 儲存液(1.25 mol/L) 1 μL，混勻后37 ℃水沐中避光反應(yīng)30 min；離心棄上清，PBS洗滌2次后用流式細胞儀FL1通道檢測細胞發(fā)射的熒光。

2 結(jié) 果

2.1 JC-1法檢測CCCP對線粒體膜電位的影響

裝載JC-1探針、流式細胞術(shù)分析CCCP處理后細胞內(nèi)綠色熒光的變化，結(jié)果表明，細胞內(nèi)代表JC-1單體的綠色熒光隨CCCP濃度而增加(圖1)。

圖 1 JC-1法檢測CCCP對線粒體膜電位的影響

2.2 Rh123法分析CCCP對線粒體膜電位的影響

Rh123染色后、流式細胞術(shù)分析CCCP處理后細胞內(nèi)綠色熒光的變化(圖2)。與對照組比較，0.1 μmol CCCP處理后，Rh123的熒光強度下降，但伴隨CCCP濃度增加(1和10 μmol)后，Rh123的綠色熒光反而增加，即熒光強度與CCCP對線粒體功能損傷的效應(yīng)未呈現(xiàn)對應(yīng)關(guān)系。

圖 2 Rh123法分析CCCP對線粒體膜電位的影響

3 討 論

線粒體是細胞內(nèi)能量轉(zhuǎn)換和控制細胞凋亡的重要細胞器，也決定生存與死亡的控制中心[3]。部分不育男性的精子運動能力下降，可檢測到精子的線粒體膜電位下降。心臟在缺血后再灌注時，心肌細胞內(nèi)活性氧增加，導(dǎo)致細胞線粒體功能受損和線粒體膜電位下降。增殖旺盛的腫瘤細胞，線粒子功能活躍，而采用藥物干預(yù)線粒體功能是治療腫瘤的策略之一。簡言之，檢測線粒體功能在細胞生物學(xué)、臨床醫(yī)學(xué)和腫瘤學(xué)等研究領(lǐng)域中均有重要應(yīng)用。

熒光染料Rh123可因線粒體內(nèi)外的電位差而吸附結(jié)合于線粒體，成為分析線粒體功能的常用染料[4]。但被檢測的細胞大量壞死或發(fā)生晚期凋亡后，細胞膜的通透性增加，加速Rh123進入細胞內(nèi)，線粒體對其吸附的能力下降；在染色后洗滌的過程中，Rh123又不同程度地漏出。實際工作中發(fā)現(xiàn)，細胞發(fā)生嚴(yán)重壞死的情況下，Rh123的熒光與線粒體膜電位無較好對應(yīng)關(guān)系。JC-1是一種新型熒光探針，進入線粒體后，其存在狀態(tài)和發(fā)射熒光與線粒體的功能聯(lián)系緊密：在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，可以產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體基質(zhì)中，此時JC-1主要以單體形式存在，發(fā)綠色熒光[5]。CCCP可以濃度依賴的方式損傷線粒體功能，導(dǎo)致線粒體膜電位下降。通過研究發(fā)現(xiàn)，在不同濃度CCCP處理后，JC-1染色后所檢測的綠色熒光強度隨著CCCP濃度增加而增強。但以Rh123為探針，其發(fā)射的熒光在CCCP濃度較高時，呈現(xiàn)假性增加的趨勢。

簡言之，與Rh123比較，JC-1是更為理想的檢測線粒體膜電位的熒光探針。除探針種類的因素外，實驗過程尚需要在如下方面注意，以保證分析結(jié)果穩(wěn)定：①在培養(yǎng)瓶或孔板內(nèi)所接種細胞量要適當(dāng)，以免細胞密度過高導(dǎo)致代謝毒性產(chǎn)物增加、細胞生長受抑制；②可嘗試不同的消化液來消化、傳代細胞，避免此過程中過度損傷細胞；③洗滌細胞的過程中，可用移液器吸去上清液，既減少細胞的丟失又減少液體殘留，達到充分洗滌未結(jié)合的探針的目的。

致謝：感謝公共衛(wèi)生學(xué)院王長文副教授在文獻閱讀和英文寫作過程中給予的悉心指導(dǎo)。

參考文獻：

[1] Ou Xianghong,Li Sen,Wang Zhenbo,et al.Maternal insulin resistance causes oxidative stress and mitochondrial dysfunction in mouseoocytes[J].Hum Reprod,2012,27(7):2130-2145.

[2] 陳 莎，張 翔，張舒越，等.抗霉素A直接刺激線粒體所引起的超氧陰離子含量和膜電位變化的單線粒體水平研究[J].廈門大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版,2013,52(4):525-528.

[3] Kroemer G,Reed J C.Mitochondrial control of cell death[J].Nat Med,2000,6(5):513-519.

[4] 安 冉，董 強.凋亡過程中線粒體膜透化的常用檢測方法[J].中華腦血管病雜志:電子版，2009,3(1):33-37.

[5] 李 妍.流式細胞術(shù)入門及平臺化管理[M].長春：吉林大學(xué)出版社，2012.