王蕾　宿烽

摘要：本試驗的目的是建立一套完整的番茄體外組培繁殖體系，并對組培過程中容易出現(xiàn)的褐化現(xiàn)象進行控制性研究。結果表明：誘導愈傷組織的最適外植體為子葉，其最適植物生長調節(jié)劑濃度為0.6 mg/L IAA+2 mg/L 6-BA。苗齡為6 d的子葉出愈情況最好。誘導不定芽的最適植物生長調節(jié)劑濃度為0.3 mg/L IAA+2 mg/L 6-BA。在培養(yǎng)基中添加200、600 mg/L的活性炭或10 mg/L的VC，愈傷組織和不定芽形成過程中的褐化現(xiàn)象可得到有效控制。最適生根方法為兩步生根法，其最佳的NAA浸泡濃度為50 mg/L。最適條件下，50 d左右便可得到完整的再生植株。

關鍵詞：番茄；組織培養(yǎng)；褐化

中圖分類號：S641.203.6 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2014）03-0009-04

AbstractA complete set of in vitro propagation system of tomato was established and the browning phenomenon in this process was studied. The results showed that the optimum explant for callus inducing was cotyledon， and the optimum plant growth regulator was 0.6 mg/L IAA+2 mg/L 6-BA. The 6-day cotyledon had the best callus induction effect. The optimum plant growth regulator concentration for budding was 0.3 mg/L IAA+2 mg/L 6-BA. Adding 200， 600 mg/L activated carbon or 10 mg/L VC into medium， the browning phenomenon could be controlled effectively in the formation of calluses and adventitious buds. The optimum rooting method was indirect rooting method， and its optimum NAA concentration was 50 mg/L. Under these optimum conditions， a whole regenerated plantlet could be obtained in about 50 days.

Key wordsTomato； Tissue culture； Browning

番茄是典型的雙子葉植物，是植物學領域研究最多的模式植物之一。不同基因型番茄在相同的培養(yǎng)基上，可以發(fā)生不同的脫分化和再分化現(xiàn)象[1]，說明基因型是影響番茄組織培養(yǎng)的重要因素之一。不同的番茄外植體，如根、子葉、莖尖分生組織等，進行離體繁殖培養(yǎng)時，其植物生長調節(jié)劑的種類和配比也存在差異[1～3]。因此，每一個番茄品種的再生系統(tǒng)都是一個獨立的體系，需要具體試驗獲得。

褐化現(xiàn)象嚴重影響外植體的脫分化和再分化過程。因此，抑制褐化的發(fā)生可以大大提高外植體的成活率，有利于番茄再生體系的建立。褐化現(xiàn)象主要發(fā)生在外植體、愈傷組織繼代、懸浮細胞培養(yǎng)等過程中。褐變的機理是由于細胞受脅迫或其他不利條件影響而死亡或自然死亡時，材料傷口分泌的酚類物質在多酚氧化酶作用下氧化為醌類物質形成的[4]。番茄是含酚類物質較多的蔬菜，在組織培養(yǎng)過程中很容易發(fā)生褐變，從而引起代謝紊亂，停止分化，最終死亡。目前，許多研究人員對番茄褐化現(xiàn)象的控制做了研究[4，5]，但由于培養(yǎng)條件、基因型等多方面因素的影響，試驗重復性較差。

本試驗以櫻桃番茄“粉麗莎”為材料，探討番茄體外組培的最適條件，建立了一套完整的番茄離體再生系統(tǒng)。并對培養(yǎng)過程中的褐化現(xiàn)象進行遏制性研究，以期為今后其他番茄品種的離體組織培養(yǎng)提供理論指導和技術參考。

1材料與方法

1.1材料與試劑

以櫻桃番茄品種“粉麗莎”為材料，進行體外組織培養(yǎng)和褐化現(xiàn)象遏制條件的研究。

所用培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基或1/2MS培養(yǎng)基；植物生長調節(jié)劑為吲哚乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）、6-芐基氨基嘌呤（6-enzyladenind，6-BA）、2-（1-萘基）乙酸（1-naphthylacetic acid，NAA）。

1.2試驗方法

1.2.1無菌苗培養(yǎng)選取籽粒飽滿的番茄種子，清水浸泡5 h左右。待種子完全吸漲后，進行消毒處理：75%酒精浸泡30～60 s，10% NaClO消毒3 min，無菌水沖洗后轉入1/2MS固體培養(yǎng)基（培養(yǎng)基中添加30 g/L蔗糖和7 g/L瓊脂[6]，pH值5.8～6.2）。組培室內暗培養(yǎng)1～2 d，然后在25℃、1 000 lx光照培養(yǎng)箱中每天光照8 h培養(yǎng)。

1.2.2外植體的獲得種子萌發(fā)需3～5 d，分別在苗齡為2、4、6、8、10 d時切取外植體。外植體選用子葉和下胚軸，子葉切成0.5 cm×0.5 cm小片、葉背向下，下胚軸切成1 cm左右的小段[7，8]，接種到培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導。

1.2.3愈傷組織和芽誘導采用MS培養(yǎng)基。IAA濃度分別為0.1、0.2、0.3、0.4、0.6 mg/L，6-BA濃度分別為2、3、4 mg/L，進行單因素試驗，篩選最佳的愈傷組織和芽誘導條件。

1.2.4褐化現(xiàn)象的遏制在篩選出的最佳培養(yǎng)基中，分別添加不同濃度的活性炭和VC，觀察對愈傷組織和芽誘導過程中褐化的遏制情況，從而篩選出最佳的活性炭和VC添加量?；钚蕴繚舛确謩e為0、200、400、600、800、1 000 mg/L，VC濃度分別為0、5、10、20、50 mg/L。

1.2.5生根誘導采用1/2MS培養(yǎng)基。利用一步生根法和兩步生根法，分別誘導生根。一步生根法即將長勢粗壯的不定芽，轉入含有不同濃度NAA的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，NAA濃度分別為0、0.5、1、2 mg/L。兩步生根法即先將不定芽放入含NAA的溶液中浸泡5 h，再轉入不含植物生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，NAA浸泡液濃度分別為10、20、50、70 mg/L。

分別統(tǒng)計愈傷組織、芽和根的誘導率。

愈傷組織誘導率（%）=（發(fā)生愈傷組織外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100

不定芽誘導率（%）=（分化出不定芽的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100[9]

根誘導率（%）=（發(fā)生根的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100

1.2.6離體再生體系的建立

在植物生長調節(jié)劑的作用下，外植體經暗培養(yǎng)，誘導愈傷組織；然后經光照培養(yǎng)，誘導芽；最后對分離的不定芽誘導生根。每階段以10 d為周期，進行繼代培養(yǎng)。當生根成功，整個體外再生系統(tǒng)的建立即完成。

2結果與分析

2.1生長調節(jié)劑對愈傷組織誘導率的影響

植物生長調節(jié)劑的濃度及配比是誘導愈傷組織形成的重要條件。以苗齡為6 d的番茄無菌苗為材料，獲取子葉和下胚軸進行研究。不同植物生長調節(jié)劑濃度及配比誘導番茄愈傷組織情況如表1。

由表1可知，同等濃度的植物生長調節(jié)劑對子葉的愈傷組織誘導率高于下胚軸，子葉為番茄體外組織培養(yǎng)的最佳外植體，其最佳植物生長調節(jié)劑濃度為0.6 mg/L IAA+2 mg/L 6-BA，此時，愈傷組織誘導率最高，為100%。

2.2苗齡對愈傷組織誘導率的影響

由2.1結果可知，子葉為番茄體外組織培養(yǎng)的最佳外植體。在最佳植物生長調節(jié)劑濃度下，對不同苗齡的子葉進行愈傷組織誘導，研究苗齡與愈傷組織誘導率之間的關系（表2）。

由表2可知，以子葉為外植體誘導愈傷組織的最佳苗齡為6 d，此時愈傷組織的誘導率高，組織形態(tài)好，表面光滑有光澤，結構致密，多為淡黃色或白色，器官發(fā)生潛力大，易于生芽。

3結論與討論

本試驗成功建立了“粉麗莎”櫻桃番茄的體外繁殖體系，不僅具有降低栽種成本的現(xiàn)實經濟意義，對今后其他品種體外繁殖系統(tǒng)的建立也提供了有力的技術支持。同時完善的體外再生系統(tǒng)，為番茄的轉基因研究提供了良好的受體系統(tǒng)，保障了番茄基因轉化的高效性，在番茄新品種培育、基因功能性研究等方面將發(fā)揮巨大作用。

在培養(yǎng)基中加入吸附劑或抗氧化劑可有效遏制褐變的產生，活性炭可以吸附外植體釋放的酚類物質，使其不受毒害；VC能夠阻止多酚氧化酶對酚類物質的氧化，兩者均能減少褐變的發(fā)生。但試驗結果表明，并不是活性炭或VC的濃度越高效果就越好。其原因在于一定濃度的活性炭，可以吸附外植體產生的酚類物質以及由此氧化產生的致死性醌類物質，且對瓊脂中的雜質也有一定的吸附作用，但當活性炭濃度過高時，不僅吸收了有害物質，也吸收了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)，因而對外植體的生長產生了抑制作用。同樣，一定濃度的VC能夠控制褐化現(xiàn)象的發(fā)生，但高濃度的VC會對培養(yǎng)物產生一定的干擾和毒害作用[4]。通過比較，低濃度的VC比活性炭具有更強的抑制褐化發(fā)生的能力。

本研究結果顯示，兩步生根法有利于番茄的生根，其原理可能是采用浸泡的方式能夠使根原基充分地吸收生長素，而根原基形成后幼根的生長并不需要高濃度的生長素，高濃度的生長素反而會抑制其生長，兩步生根法正好符合了以上要求，因此更適合根的誘導。其具體機理還有待進一步的研究證實。

參考文獻：

[1]任永霞， 王罡， 郭郁頻， 等. 番茄組織培養(yǎng)及其農桿菌介導類胡蘿卜素合成酶基因LvcB的遺傳轉化[J]. 北方園藝， 2006（1）：98-100.

[2]何秀霞， 陸一鳴， 白杰英， 等. 番茄組織培養(yǎng)體系的建立及其影響因素的研究[J]. 內蒙古民族大學學報：自然科學版， 2003， 18（1）： 30-33.

[3]畢建水， 李翠翠， 徐麗麗. 培養(yǎng)基和繼代時間對番茄葉片愈傷組織誘導和芽分化的影響[J].安徽農學通報， 2008， 14（13）： 41-42.

[4]潘娟， 李先源， 李名楊. 植物組織培養(yǎng)過程中常見問題及解決方法[J]. 安徽農業(yè)科學， 2009， 37（6）： 2392-2394.

[5]陳強， 劉燁，畢曉華. 番茄愈傷組織誘導和VC控制外植體褐變[J]. 科技信息， 2008（22）：84-85.

[6]梅茜， 張興國. 黃瓜組織研究培養(yǎng)[J]. 西南農業(yè)大學學報， 2002， 24（3）： 125-128.

[7]汪祖程， 何丹， 徐躍進.黃瓜子葉外植體組培成株研究[J]. 北方園藝， 2008（6）：187-189.

[8]Ozyigit I I， Kahraman M V， Ercan O. Relation between explants age， total phenols and regeneration response in tissue cultured cotton（Gossypium hirsutum L.） [J]. African Journal of Biotechnology， 2007， 6（1）： 3-8.

[9]Qiu D L， Diretto G， Tavarza R， et al. Improved protocol for Agrobacterium mediated transformation of tomato and production of transgenic plants containing carotenoid biosynthetic gene CsZCD[J]. Scientia Horticulturae， 2007， 112（2）： 172-175.

1.2.5生根誘導采用1/2MS培養(yǎng)基。利用一步生根法和兩步生根法，分別誘導生根。一步生根法即將長勢粗壯的不定芽，轉入含有不同濃度NAA的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，NAA濃度分別為0、0.5、1、2 mg/L。兩步生根法即先將不定芽放入含NAA的溶液中浸泡5 h，再轉入不含植物生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，NAA浸泡液濃度分別為10、20、50、70 mg/L。

分別統(tǒng)計愈傷組織、芽和根的誘導率。

愈傷組織誘導率（%）=（發(fā)生愈傷組織外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100

不定芽誘導率（%）=（分化出不定芽的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100[9]

根誘導率（%）=（發(fā)生根的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100

1.2.6離體再生體系的建立

在植物生長調節(jié)劑的作用下，外植體經暗培養(yǎng)，誘導愈傷組織；然后經光照培養(yǎng)，誘導芽；最后對分離的不定芽誘導生根。每階段以10 d為周期，進行繼代培養(yǎng)。當生根成功，整個體外再生系統(tǒng)的建立即完成。

2結果與分析

2.1生長調節(jié)劑對愈傷組織誘導率的影響

植物生長調節(jié)劑的濃度及配比是誘導愈傷組織形成的重要條件。以苗齡為6 d的番茄無菌苗為材料，獲取子葉和下胚軸進行研究。不同植物生長調節(jié)劑濃度及配比誘導番茄愈傷組織情況如表1。

由表1可知，同等濃度的植物生長調節(jié)劑對子葉的愈傷組織誘導率高于下胚軸，子葉為番茄體外組織培養(yǎng)的最佳外植體，其最佳植物生長調節(jié)劑濃度為0.6 mg/L IAA+2 mg/L 6-BA，此時，愈傷組織誘導率最高，為100%。

2.2苗齡對愈傷組織誘導率的影響

由2.1結果可知，子葉為番茄體外組織培養(yǎng)的最佳外植體。在最佳植物生長調節(jié)劑濃度下，對不同苗齡的子葉進行愈傷組織誘導，研究苗齡與愈傷組織誘導率之間的關系（表2）。

由表2可知，以子葉為外植體誘導愈傷組織的最佳苗齡為6 d，此時愈傷組織的誘導率高，組織形態(tài)好，表面光滑有光澤，結構致密，多為淡黃色或白色，器官發(fā)生潛力大，易于生芽。

3結論與討論

本試驗成功建立了“粉麗莎”櫻桃番茄的體外繁殖體系，不僅具有降低栽種成本的現(xiàn)實經濟意義，對今后其他品種體外繁殖系統(tǒng)的建立也提供了有力的技術支持。同時完善的體外再生系統(tǒng)，為番茄的轉基因研究提供了良好的受體系統(tǒng)，保障了番茄基因轉化的高效性，在番茄新品種培育、基因功能性研究等方面將發(fā)揮巨大作用。

在培養(yǎng)基中加入吸附劑或抗氧化劑可有效遏制褐變的產生，活性炭可以吸附外植體釋放的酚類物質，使其不受毒害；VC能夠阻止多酚氧化酶對酚類物質的氧化，兩者均能減少褐變的發(fā)生。但試驗結果表明，并不是活性炭或VC的濃度越高效果就越好。其原因在于一定濃度的活性炭，可以吸附外植體產生的酚類物質以及由此氧化產生的致死性醌類物質，且對瓊脂中的雜質也有一定的吸附作用，但當活性炭濃度過高時，不僅吸收了有害物質，也吸收了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)，因而對外植體的生長產生了抑制作用。同樣，一定濃度的VC能夠控制褐化現(xiàn)象的發(fā)生，但高濃度的VC會對培養(yǎng)物產生一定的干擾和毒害作用[4]。通過比較，低濃度的VC比活性炭具有更強的抑制褐化發(fā)生的能力。

本研究結果顯示，兩步生根法有利于番茄的生根，其原理可能是采用浸泡的方式能夠使根原基充分地吸收生長素，而根原基形成后幼根的生長并不需要高濃度的生長素，高濃度的生長素反而會抑制其生長，兩步生根法正好符合了以上要求，因此更適合根的誘導。其具體機理還有待進一步的研究證實。

參考文獻：

[1]任永霞， 王罡， 郭郁頻， 等. 番茄組織培養(yǎng)及其農桿菌介導類胡蘿卜素合成酶基因LvcB的遺傳轉化[J]. 北方園藝， 2006（1）：98-100.

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[3]畢建水， 李翠翠， 徐麗麗. 培養(yǎng)基和繼代時間對番茄葉片愈傷組織誘導和芽分化的影響[J].安徽農學通報， 2008， 14（13）： 41-42.

[4]潘娟， 李先源， 李名楊. 植物組織培養(yǎng)過程中常見問題及解決方法[J]. 安徽農業(yè)科學， 2009， 37（6）： 2392-2394.

[5]陳強， 劉燁，畢曉華. 番茄愈傷組織誘導和VC控制外植體褐變[J]. 科技信息， 2008（22）：84-85.

[6]梅茜， 張興國. 黃瓜組織研究培養(yǎng)[J]. 西南農業(yè)大學學報， 2002， 24（3）： 125-128.

[7]汪祖程， 何丹， 徐躍進.黃瓜子葉外植體組培成株研究[J]. 北方園藝， 2008（6）：187-189.

[8]Ozyigit I I， Kahraman M V， Ercan O. Relation between explants age， total phenols and regeneration response in tissue cultured cotton（Gossypium hirsutum L.） [J]. African Journal of Biotechnology， 2007， 6（1）： 3-8.

[9]Qiu D L， Diretto G， Tavarza R， et al. Improved protocol for Agrobacterium mediated transformation of tomato and production of transgenic plants containing carotenoid biosynthetic gene CsZCD[J]. Scientia Horticulturae， 2007， 112（2）： 172-175.

1.2.5生根誘導采用1/2MS培養(yǎng)基。利用一步生根法和兩步生根法，分別誘導生根。一步生根法即將長勢粗壯的不定芽，轉入含有不同濃度NAA的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，NAA濃度分別為0、0.5、1、2 mg/L。兩步生根法即先將不定芽放入含NAA的溶液中浸泡5 h，再轉入不含植物生長調節(jié)劑的培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)，NAA浸泡液濃度分別為10、20、50、70 mg/L。

分別統(tǒng)計愈傷組織、芽和根的誘導率。

愈傷組織誘導率（%）=（發(fā)生愈傷組織外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100

不定芽誘導率（%）=（分化出不定芽的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100[9]

根誘導率（%）=（發(fā)生根的外植體數(shù)/接種外植體數(shù)）×100

1.2.6離體再生體系的建立

在植物生長調節(jié)劑的作用下，外植體經暗培養(yǎng)，誘導愈傷組織；然后經光照培養(yǎng)，誘導芽；最后對分離的不定芽誘導生根。每階段以10 d為周期，進行繼代培養(yǎng)。當生根成功，整個體外再生系統(tǒng)的建立即完成。

2結果與分析

2.1生長調節(jié)劑對愈傷組織誘導率的影響

植物生長調節(jié)劑的濃度及配比是誘導愈傷組織形成的重要條件。以苗齡為6 d的番茄無菌苗為材料，獲取子葉和下胚軸進行研究。不同植物生長調節(jié)劑濃度及配比誘導番茄愈傷組織情況如表1。

由表1可知，同等濃度的植物生長調節(jié)劑對子葉的愈傷組織誘導率高于下胚軸，子葉為番茄體外組織培養(yǎng)的最佳外植體，其最佳植物生長調節(jié)劑濃度為0.6 mg/L IAA+2 mg/L 6-BA，此時，愈傷組織誘導率最高，為100%。

2.2苗齡對愈傷組織誘導率的影響

由2.1結果可知，子葉為番茄體外組織培養(yǎng)的最佳外植體。在最佳植物生長調節(jié)劑濃度下，對不同苗齡的子葉進行愈傷組織誘導，研究苗齡與愈傷組織誘導率之間的關系（表2）。

由表2可知，以子葉為外植體誘導愈傷組織的最佳苗齡為6 d，此時愈傷組織的誘導率高，組織形態(tài)好，表面光滑有光澤，結構致密，多為淡黃色或白色，器官發(fā)生潛力大，易于生芽。

3結論與討論

本試驗成功建立了“粉麗莎”櫻桃番茄的體外繁殖體系，不僅具有降低栽種成本的現(xiàn)實經濟意義，對今后其他品種體外繁殖系統(tǒng)的建立也提供了有力的技術支持。同時完善的體外再生系統(tǒng)，為番茄的轉基因研究提供了良好的受體系統(tǒng)，保障了番茄基因轉化的高效性，在番茄新品種培育、基因功能性研究等方面將發(fā)揮巨大作用。

在培養(yǎng)基中加入吸附劑或抗氧化劑可有效遏制褐變的產生，活性炭可以吸附外植體釋放的酚類物質，使其不受毒害；VC能夠阻止多酚氧化酶對酚類物質的氧化，兩者均能減少褐變的發(fā)生。但試驗結果表明，并不是活性炭或VC的濃度越高效果就越好。其原因在于一定濃度的活性炭，可以吸附外植體產生的酚類物質以及由此氧化產生的致死性醌類物質，且對瓊脂中的雜質也有一定的吸附作用，但當活性炭濃度過高時，不僅吸收了有害物質，也吸收了培養(yǎng)基中的營養(yǎng)，因而對外植體的生長產生了抑制作用。同樣，一定濃度的VC能夠控制褐化現(xiàn)象的發(fā)生，但高濃度的VC會對培養(yǎng)物產生一定的干擾和毒害作用[4]。通過比較，低濃度的VC比活性炭具有更強的抑制褐化發(fā)生的能力。

本研究結果顯示，兩步生根法有利于番茄的生根，其原理可能是采用浸泡的方式能夠使根原基充分地吸收生長素，而根原基形成后幼根的生長并不需要高濃度的生長素，高濃度的生長素反而會抑制其生長，兩步生根法正好符合了以上要求，因此更適合根的誘導。其具體機理還有待進一步的研究證實。

參考文獻：

[1]任永霞， 王罡， 郭郁頻， 等. 番茄組織培養(yǎng)及其農桿菌介導類胡蘿卜素合成酶基因LvcB的遺傳轉化[J]. 北方園藝， 2006（1）：98-100.

[2]何秀霞， 陸一鳴， 白杰英， 等. 番茄組織培養(yǎng)體系的建立及其影響因素的研究[J]. 內蒙古民族大學學報：自然科學版， 2003， 18（1）： 30-33.

[3]畢建水， 李翠翠， 徐麗麗. 培養(yǎng)基和繼代時間對番茄葉片愈傷組織誘導和芽分化的影響[J].安徽農學通報， 2008， 14（13）： 41-42.

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[5]陳強， 劉燁，畢曉華. 番茄愈傷組織誘導和VC控制外植體褐變[J]. 科技信息， 2008（22）：84-85.

[6]梅茜， 張興國. 黃瓜組織研究培養(yǎng)[J]. 西南農業(yè)大學學報， 2002， 24（3）： 125-128.

[7]汪祖程， 何丹， 徐躍進.黃瓜子葉外植體組培成株研究[J]. 北方園藝， 2008（6）：187-189.

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[9]Qiu D L， Diretto G， Tavarza R， et al. Improved protocol for Agrobacterium mediated transformation of tomato and production of transgenic plants containing carotenoid biosynthetic gene CsZCD[J]. Scientia Horticulturae， 2007， 112（2）： 172-175.