吳 銘,劉 根,王京偉,王攀紅,韓晶晶,黃紅瑩

(河南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河南 開封 475004)

研究[1-2]顯示：近年來耐藥金黃色葡萄球菌( S． aureus)感染是醫(yī)院感染的重要病原菌之一，尤其在植入性醫(yī)療材料表面生長形成生物膜是感染發(fā)生的重要原因。此生物膜一旦形成，抗生素、化學(xué)消毒劑等均難以滲透, 易產(chǎn)生耐藥性，抗感染治療效果不佳。因此，對(duì)臨床耐藥菌株生物膜形成及其抑制因素的研究已成為抗感染領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[3-5]。決明子是醫(yī)院常用的藥用植物，具有清肝明目、潤腸通便的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究[6]表明，決明子具有抗菌作用， 是國家衛(wèi)生部公布的藥食同源的物質(zhì)之一。程玲鈴等[7]研究顯示：決明子提取物中大黃素甲醚對(duì)金黃色葡萄球菌等多種細(xì)菌均有抑制作用。我們研究首先對(duì)金黃色葡萄球菌菌膜培養(yǎng)條件進(jìn)行了摸索，然后調(diào)查了 20 株不同來源分離株的菌膜形成狀況并對(duì)草決明影響細(xì)菌生物膜的作用進(jìn)行了研究，測定了臨床菌株及金葡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株最低抑菌濃度及草決明對(duì)細(xì)菌生長的影響，初步探討了草決明抑制細(xì)菌生長的作用機(jī)制。 為實(shí)際環(huán)境中菌膜的預(yù)防和控制及草決明的臨床用藥提供一定的理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

①菌種: 金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株25923由河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供，耐藥金葡菌臨床分離菌株(MRSA菌株)20株由河南大學(xué)附屬淮河醫(yī)院微生物檢驗(yàn)科提供。②中藥: 草決明購于同仁堂大藥房。③培養(yǎng)基：普通肉湯、營養(yǎng)瓊脂、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基等購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 主要儀器

生物安全柜(蘇凈集團(tuán)安泰公司)、恒溫培養(yǎng)箱(上海福碼)、恒溫?fù)u床(Thermo forma)、高速臺(tái)式離心機(jī)(eppendorf)、多功能酶標(biāo)儀(Thermo)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 草決明水提液及醇提液的制備 由藥學(xué)院中草藥實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3.2 最低抑菌濃度( MIC)測定 取活化的金葡菌，接種于普通肉湯培養(yǎng)基。于200 rpm/min 37 ℃搖床培養(yǎng)7 h，經(jīng)比濁判定菌量后, 稀釋至含菌量為105～106cfu /mL(0.5麥?zhǔn)隙?的菌懸液為目標(biāo)菌液。于96孔板中，將滅菌后的草決明水提液及醇提溶液用無菌營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基配置成系列濃度稀釋液(50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL)，同時(shí)用生理鹽水做空白對(duì)照，然后在無菌操作條件下，接種對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌液 20 μL，搖勻，37 ℃培養(yǎng) 24 h。受試菌株的MIC 測定, 以微量肉湯稀釋法培養(yǎng)24 h 后, 肉眼未見細(xì)菌生長的藥物最低濃度為MIC，經(jīng)涂板菌落計(jì)數(shù)<5的為最低殺菌濃度。

1.3.3 金黃色葡萄球菌生長抑制實(shí)驗(yàn) 金黃色葡萄球菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，用LB 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基將其稀釋成含菌體107個(gè)/mL，于37 ℃，200 r/min 培養(yǎng)12 h，每隔2 h 取樣測OD 600值，繪制對(duì)照組生長曲線; 再取一定量對(duì)數(shù)期的金黃色葡萄球菌加入到含草決明醇提溶液的LB 培養(yǎng)基中(草決明醇提液濃度為1/2 MIC)，使含菌體107個(gè)/mL，繼續(xù)培養(yǎng)并每隔2 h 取樣測OD 600值，制作出草決明醇提液作用后的金黃色葡萄球菌生長曲線。

1.3.4 生物膜形成實(shí)驗(yàn) 將TSB肉湯中培養(yǎng) 18 h的金黃色葡萄球菌調(diào)至0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)濁度，用TSB肉湯進(jìn)行1∶100稀釋，取菌液加入96孔培養(yǎng)板中，每株4個(gè)平行孔，封好四周，37 ℃培養(yǎng)24 h。用微量移液器小心吸干菌液后，用 PBS(pH7.2)緩沖液洗板3次，自然干燥；每孔加入甲醇固定液200 μL，固定20 min。自然晾干，加入5 g/L結(jié)晶紫染色20 min，用自來水沖洗，干燥。實(shí)驗(yàn)以TSB肉湯作為空白對(duì)照，金黃色葡萄球菌ATCC25923作為陰性對(duì)照。

1.3.5 生物膜形成抑制實(shí)驗(yàn) 選用草決明醇提液的1/2、1/4、1/8 MIC為單獨(dú)用藥濃度。在96孔板中加入草決明醇提液100 μL+菌液100 μL；同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照組(不加藥物)，37 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行染色，用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇脫色，酶標(biāo)儀測定OD值，計(jì)算出A570的平均值。 每次測定均重復(fù)測3次計(jì)算平均值。

1.3.6 草決明-NaCl和草決明-蒸餾水的金葡菌滲透試驗(yàn) 分別配制菌液濃度為106cfu/mL的含不同濃度NaCl和 1/2 MIC濃度草決明醇提液的營養(yǎng)肉湯3 mL,37 ℃搖菌培養(yǎng)12 h,然后在600 nm 下,以不含細(xì)菌的營養(yǎng) 肉湯作空白,測定每管吸光度。分別配制細(xì)菌懸液為106cfu/mL的不同濃度草決明醇提液的營養(yǎng)肉湯3 mL(1/2、1/4、1/8 MIC 濃度),以不加藥物的營養(yǎng)肉湯為陰性對(duì)照，37 ℃搖菌培養(yǎng)12 h,蒸餾水處理，于0,4,8,12和24 h時(shí)取100 μL菌懸液在瓊脂平板上劃線培養(yǎng)并計(jì)數(shù)菌落。

2 結(jié)果

2.1 最低抑菌濃度測定

草決明水提液對(duì)金葡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株的MIC均為50 μg/mL，醇提液對(duì)金葡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和臨床菌株的MIC 25 μg/mL 、6.25 μg/mL。

2.2 金黃色葡萄球菌生長曲線

當(dāng)加入1/2 MIC的草決明醇提液時(shí)，金葡菌生長的最高OD值降低，與未加藥組比較差異不顯著，見圖1。

2.3 金葡菌生物膜形成實(shí)驗(yàn)

不同來源分離株的金葡菌粘附實(shí)驗(yàn)結(jié)果：12株菌經(jīng)結(jié)晶紫染色后菌膜形成明顯，8株有菌膜形成但菌膜較薄，金葡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株菌膜形成陰性。

2.4 草決明對(duì)耐藥金葡菌生物膜形成的影響

草決明醇提液的1/2、1/4 MIC均可明顯抑制臨床耐藥金葡菌生物膜形成，見圖2。

圖1 金葡菌生長曲線(藥物濃度：1/2 MIC)

圖2 草決明對(duì)耐藥金葡菌生物膜形成的影響

2.5 草決明醇提液-NaCl的金葡菌滲透試驗(yàn)

不加草決明醇提液時(shí), 隨著NaCl濃度上升, 測試管的吸光度逐漸下降, 當(dāng)NaC l濃度達(dá)到14% 時(shí)吸光度接近零, 說明隨著NaCl濃度上升, 存活的細(xì)菌越來越來少, 當(dāng)NaCl濃度達(dá)到18% 時(shí)細(xì)菌即不再生長。當(dāng)1/2 MIC草決明醇提液與不同濃度NaCl共同作用時(shí), NaCl濃度分別達(dá)到10%、12% 時(shí)吸光度接近零, 說明細(xì)菌對(duì)NaCl溶液的耐受能力并無明顯變化,亦說明藥物處理后細(xì)菌細(xì)胞壁滲透力未明顯改變。

2.6 草決明醇提液-蒸餾水的金葡菌滲透試驗(yàn)

蒸餾水處理后，隨時(shí)間的延長, 不含草決明醇提液的金葡菌懸液菌落計(jì)數(shù)逐漸減少,12 h后菌落數(shù)迅速減少；24 h 后仍有少數(shù)菌落存活(耐藥菌490 cfu/mL，標(biāo)準(zhǔn)金葡菌267 cfu/mL)。隨著加入草決明醇提液濃度的增高, 細(xì)菌菌落數(shù)逐漸減少,隨著時(shí)間的變化，12 h后菌落數(shù)迅速減少；24 h 后仍有少數(shù)菌落存活(1/2 MIC醇提液中耐藥菌2.6 cfu/ml，標(biāo)準(zhǔn)金葡菌6.9 cfu/mL)。與未加藥菌懸液變化趨勢一致，說明草決明醇提液未明顯改變金葡菌細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，蒸餾水對(duì)金葡菌的溶菌能力變化不明顯,見表1。

表1 金葡菌蒸餾水滲透實(shí)驗(yàn)(菌落計(jì)數(shù)cfu/L)

3 討論

耐藥金黃色葡萄球菌是細(xì)菌生物膜的主要形成菌, 研究顯示：細(xì)菌形成菌膜后，菌體對(duì)外界各種理化因子的耐受能力會(huì)大大增強(qiáng)，能夠提高細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的抗性和抗吞噬作用[8-11]。菌膜狀態(tài)的金黃色葡萄球菌可引發(fā)多方面的問題：與感染反復(fù)發(fā)作有關(guān)，也是造成靜脈導(dǎo)管及其他醫(yī)療裝置相關(guān)感染的主要原因，并且由于對(duì)抗生素、免疫系統(tǒng)等抵抗能力的增強(qiáng)，增加了對(duì)上述疾病的治療難度[12]； 因此，對(duì)于金黃色葡萄球菌菌膜的研究十分重要。

有學(xué)者研究[7]證實(shí)：草決明的乙醇提取物及氯仿提取物對(duì)多種細(xì)菌均有抑制作用。 為研究草決明對(duì)耐藥金葡菌的抗菌作用及菌膜形成的影響，我們從臨床患者體內(nèi)取得耐藥金葡菌，首先觀察其生物膜形成能力，然后挑選生物膜陽性菌株進(jìn)行研究，以金葡菌標(biāo)準(zhǔn)菌株為對(duì)照，測定了草決明水提液及醇提液的最低抑菌濃度，結(jié)果證明醇提液的抗菌作用較強(qiáng)，尤其對(duì)耐藥金葡菌作用明顯。然后通過觀察草決明醇提液對(duì)耐藥金葡菌生物膜形成的影響，證實(shí)草決明醇提液具有抑制耐藥金葡菌生物膜形成的作用。最后我們通過草決明-NaCl和草決明-蒸餾水的金葡菌滲透試驗(yàn)，探討了不同濃度草決明醇提液對(duì)金葡菌細(xì)胞壁的影響，結(jié)果證實(shí)：隨著醇提液濃度的升高，金葡菌細(xì)胞壁的滲透能力無明顯變化,說明草決明醇提液并未通過對(duì)金葡菌細(xì)胞壁的滲透作用影響金葡菌生物膜形成，其生物膜抑制作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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