嚴鎮(zhèn)鈞，張小兵

(1.湖北師范學院 生命科學學院， 湖北 黃石 435002;2.湖北省黃石市第十八中學，湖北 黃石 435001)

聚乙二醇介導細胞融合的優(yōu)化條件探究

嚴鎮(zhèn)鈞1，張小兵2

(1.湖北師范學院 生命科學學院， 湖北 黃石 435002;2.湖北省黃石市第十八中學，湖北 黃石 435001)

細胞融合技術是細胞工程中的一項核心基礎技術，聚乙二醇(PEG)是最常用的促融劑，廣泛地被應用于農業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保等多個領域。探討更符合細胞工程要求的、融合后的細胞更大限度地保持生理活性的、快速、有效的細胞融合條件。以牛紅細胞為實驗材料，PEG作促融劑介導牛紅細胞融合，研究不同的融合溫度、PEG作用時間、PEG的相對分子質量和PEG的質量分數等因素對細胞融合率的影響。實驗結果表明，選擇融合溫度為39℃，時間為15min，選用相對分子質量為2000、質量分數為45%的PEG，可以在細胞受毒害較小的同時得到最佳的融合效果，融合率能達到21.26%.

細胞工程；聚乙二醇；使用條件優(yōu)化研究

細胞工程是四大生物工程之一，其核心基礎技術之一是細胞融合技術。細胞與組織不同，不排斥異類、異種細胞，因此細胞融合不受種屬的局限，可實現種間生物體細胞的融合，使遠緣雜交成為可能，因而是改造細胞遺傳物質的有力手段。它的意義在于從此打破了僅僅依賴有性雜交重組基因創(chuàng)造新種的界限和生殖壁壘，極大地擴大了遺傳物質的重組范圍；細胞融合技術避免了分離、提純、剪切、拼接等基因操作，在技術和儀器設備上的要求不象基因工程那樣復雜，投資少，有利于廣泛開展研究和推廣，有著重大的實踐意義。

人工細胞融合開始于20世紀50年代，60年代到70年代作為一門新興的技術發(fā)展很快，有力地推動了生物科學各領域的發(fā)展，目前，細胞融合技術已成為研究細胞遺傳、細胞免疫、腫瘤和生物新品種培育的重要手段，其應用范圍極廣，已在農業(yè)、醫(yī)藥、環(huán)保等領域取得了開創(chuàng)性的研究成果，而且應用領域不斷擴大，其發(fā)展前景及產生的影響日益顯著。

目前有許多促使細胞融合的技術，但有些技術還處于剛剛起步階段，尚不成熟，或者存在某種生產應用方面的缺陷，例如利用滅活的仙臺病毒介導細胞融合盡管可以得到較高的融合率，對各種動物細胞都適宜，并且仙臺病毒能在牛胚中大量繁殖，但其缺點是操作復雜、不穩(wěn)定，在保存過程中促融合活性會降低，并且制備過程比較煩瑣，而且病毒引進細胞后，可能會對細胞的生命活動產生干擾，正是由于這些缺點，目前滅活的仙臺病毒已逐漸被聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG)取代；利用激光融合技術雖然易于實現特異性細胞融合,參數易于控制，操作方便，而且實驗重復性好，但它只能逐一處理細胞,不能像PEG一樣同時處理大量細胞[1]。

自從20 世紀70 年代Kao和Michayluk用PEG成功介導大麥、大豆等植物原生質體融合后[2],PEG法介導細胞融合以其容易制備、活性穩(wěn)定、不需要特別的儀器設備、操作簡便等優(yōu)點， 被普遍地

應用于生物、遺傳、醫(yī)藥等研究領域，并且是目前應用最廣泛的細胞融合的促融劑。2009年，Huynh NT等利用聚乙二醇介導細胞融合技術發(fā)展了納米醫(yī)學中的一個新領域-脂質毫超微囊劑技術[3]。Ogawa F等用PEG介導經紫外線照射形成的腫瘤細胞和轉入了IL-2基因或LacZ基因的樹狀細胞融合，融合細胞表達出了組織相容性復合體(Major Histocompatibility Complex，MHC)classI、MHCclassII、CD86、CD11c和CD8alpha[4]。Dan K等用PEG介導細胞融合的技術證明了能高效抑制單純皰疹病毒(HSV)復制的多金屬氧酸鹽PM-19并非是在病毒感染的融合階段起作用[5]。

另外，單克隆抗體技術就是通過細胞融合技術發(fā)展起來的，對生命科學的研究及醫(yī)學方面的應用產生了重大影響，其中，PEG作為促融劑發(fā)揮了不可替代的作用，比如，Bhanuprakash V等用激活的淋巴細胞和骨髓瘤細胞通過PEG介導融合制造了藍舌病病毒的單克隆抗體[6]。Changhee Yoo等用PEG(Mr=1500)介導經熱處理后的前列腺癌細胞(DU145 cells)和成熟的抗原呈遞細胞樹狀細胞(Dendritic cells ，DCs)進行雜交，制備前列腺癌細胞系疫苗[7]。Guo GH等用50% PEG介導食管癌細胞系(esophageal carcinoma cell line 109，EC109)和樹狀細胞(Dendritic cells ，DCs)融合產生抗腫瘤的雜交疫苗[8]。Homma S等用自體樹狀細胞和自體胃癌細胞通過PEG介導融合，使細胞產生抗體，再將融合后的細胞每兩周一次地注射到嚴重胃癌的患者皮下，取得了有效的臨床治療效果[9]?？傊肞EG作促融劑的細胞融合技術，已經得到了廣泛應用，而在這些應用中，學者們采用的實驗條件是不一樣的[10～14]。

目前，人們有時采用PEG介導融合技術和一些物理手段如激光融合技術相結合的方法，以進一步提高融合率。但是，影響PEG作用效果的因素較多，加大了獲得理想細胞融合率的難度[15]。本文從融合溫度、時間、PEG質量分數和相對分子質量等幾個方面，對PEG應用于細胞工程中的最適條件做了探討。

1 材料和方法

1.1材料

Alsver 液(pH7.4)、0.85%生理鹽水、GKN 液、PEG(Mr=600)、PEG(Mr=1000)、PEG(Mr=2000)、PEG(Mr=4000)、PEG(Mr=6000)、健康牛靜脈血。

1.2方法

1.2.1 牛紅細胞的獲得 取健康牛靜脈血10mL至盛有40mL Alsver溶液的瓶中，混勻后置于4℃冰箱，可保存一周。實驗時取牛血1mL，移入10mL離心管， 加入4mL 0.85%生理鹽水混勻，1200r/min離心5 min；棄上清液，加0.85%生理鹽水5mL，用指彈法將細胞團塊彈散，混勻后1000r/min離心5min，重復上述條件，再離心洗滌1次。收集最后1次離心沉淀的紅細胞。

1.2.2 細胞融合溫度的選擇 用血細胞計數法計數，將紅細胞以預熱的GKN液稀釋成細胞密度為2×107/mL的牛紅細胞懸液；分別取懸液1mL到5個試管中，每個試管加入0.5mL預熱的質量分數為50%的PEG(Mr=4000)混勻，將試管分別置于33℃、35℃、37℃、39℃、41℃水浴中溫浴15min；取融合后的細胞觀察并統(tǒng)計融合率。

1.2.3 細胞融合時間的選擇 在最適融合溫度下，分別溫浴5min、8min、13min、15min、17min，取融合后的細胞統(tǒng)計融合率。

1.2.4 PEG質量分數的選擇 在最適溫度下，分別用質量分數為35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%的PEG作為促融劑進行細胞融合，在最適融合時間取融合后的細胞統(tǒng)計融合率。

1.2.5 對PEG的選擇 在最適溫度下，分別用最適質量分數的PEG(Mr=600)、PEG(Mr=1000)、PEG(Mr=2000)、PEG(Mr=4000)、PEG(Mr=6000)作為促融劑進行細胞融合，在最適融合時間取融合后的細胞統(tǒng)計融合率。

1.2.6 細胞融合率的計算 每一次計算融合率時觀察統(tǒng)計5個視野。在顯微鏡視野內，計數觀察到的所有細胞核數以及其中已經發(fā)生融合的細胞的細胞核數，計算已經發(fā)生融合的細胞的細胞核數占細胞核總數之百分比即為融合率。

2 結果與分析

2.1PEG介導細胞融合條件的選擇

2.1.1 細胞融合溫度 溫度是影響細胞融合的重要因素。從實驗數據可以看出，當溫度不超過39℃時，細胞的融合率隨著溫度的升高而增加，溫度在39℃時融合率達到最大值，為23.24%，繼續(xù)升高融合溫度，融合率呈迅速的下降趨勢，當溫度升至41℃僅為17.75%(圖1)。因此，融合溫度選擇在35℃～39℃.

2.1.2 細胞融合時間 將細胞融合溫度控制在39℃，融合時間為15min時，融合率達到最大值25.45%，當繼續(xù)延長融合時間時，融合率并沒有隨著時間的增加而增加，至17min時，融合率為25.34%(圖2)，并且隨著時間的增加，視野中出現了越來越多的細胞破碎現象，表現為觀察到的完整細胞越來越少(表1)。因此，融合時間選擇在8～15 min.

圖1 溫度對牛紅細胞融合率的影響

圖2 PEG作用時間對牛紅細胞融合率的影響

2.1.3 PEG質量分數 分別用不同質量分數的PEG作為細胞融合的促融劑，結果表明，融合溫度在39℃，融合時間為15min時，細胞融合的效率隨著PEG質量分數的增加而升高(圖3)。但是，PEG具有一定的毒性，且其質量分數越大對細胞的毒性越大，極大地影響了融合率和融合后細胞的存活率[16]，因此，PEG的質量分數選擇在45%～55%.

2.1.4 PEG的相對分子質量分別用Mr為600、1000、2000、4000、6000的五種PEG來進行比較研究，結果表明，在這幾種PEG中，相對分子質量為600的PEG介導細胞融合的效率最低，只有14.55%，隨著相對分子質量的增加，融合率也增加，到相對分子質量為4000時，融合率高達25.73%，當PEG的相對分子質量為6000時，融合率略微升至25.87%(圖4)?？紤]到PEG的相對分子質量越大，對細胞的毒性也越大，因此，PEG的相對分子質量選擇在1000～4000.

圖3 不同的PEG質量分數對牛血細胞融合率的影響

圖4 不同Mr的PEG對牛紅血細胞融合率的影響

2.2PEG介導細胞融合條件參數的優(yōu)化和選擇

以融合溫度、融合時間、PEG質量分數和相對分子質量分別為實驗因子，每因子分別取3水平作正交實驗。正交因素水平表見表1，結果見表2.

表1 正交實驗水平因素表

表2 L9 (34)正交實驗結果

從表2可以看出：對細胞融合率的影響最大的因素是時間，其次是溫度，然后依次是PEG的相對分子質量和PEG的質量分數；所以，融合條件的最優(yōu)水平組合是A3B3C3D3.最佳條件重復性實驗結果見表3.

表3 最佳條件的重復性實驗

由表3知，最佳條件的重復性較好，故可確定最佳融合條件：溫度為39℃、時間為15min、PEG的相對分子質量為4000、質量分數為55%，融合率為25.69%.

但是, PEG的相對分子質量越大、質量分數越高，對細胞的毒性也就越大，而這兩個因素相對而言并不是影響融合率的主要因素，所以，在實際應用中，可以在保證融合效果的前提下，嘗試使用對細胞毒性較小的條件。

由于PEG的質量分數相對于其他因素而言，對融合率影響最小，PEG的相對分子質量對融合率的影響也比較小，所以分別用A1、A2代替A3B3C3D3中的A3，用B1、B2代替A3B3C3D3中的B3，將所得融合率值與表3中理論最佳條件的融合率值進行卡方分析，結果見表4.

表4 選擇條件的優(yōu)化實驗

由表4可知，P(A2B3C3D3)、P(A1B3C3D3)均大于0.05，故在實踐中可用A2或A1代替A3.如果用A2代替，則可以獲得較多的融合細胞；如果用A1代替，則可以更大程度地減少對細胞的毒害，從減少對細胞的毒害這一思想出發(fā)，用A1代替A3更好。P(A3B2C3D3)大于0.05，P(A3B1C3D3)小于0.05，故在實踐中如用B1代替B3則得到的融合率太低，而可用B2代替B3.

所以，在實踐上，細胞融合條件的一種較理想水平組合宜為A1B2C3D3，重復性實驗結果見表5.

表5 理想選擇條件的重復性實驗

由表5可看到，該理想選擇條件的重復性較好，故可確定在實踐中的一種理想融合條件為溫度為39℃、時間為15min、PEG的相對分子質量為2000、質量分數為45%，融合率為21.26%.

3 討論

融合率在一定范圍內隨溫度的升高而增大，在39 ℃時最大，繼續(xù)升高溫度時不僅融合率下降，而且細胞狀態(tài)不良。細胞融合的最適時間為15 min, 但是隨著融合時間的延長，融合率反而有所下降, 這可能是因為PEG作用時間過長, 對細胞毒害太大，導致了更多融合細胞變形甚至破裂所致。

細胞融合率與PEG的相對分子質量及其質量分數成正比, 但PEG的相對分子質量越大、體積分數越高, 對細胞的毒性也就越大。為了兼顧二者, 在以往實驗時常常采用的PEG相對分子質量一般為4000和6000，質量分數一般為40%～60%。盡管本實驗在選擇范圍內所用的PEG當相對分子質量為4000，質量分數為55%時，融合率最高，但是時間、溫度是影響融合率的主要因素，PEG的相對分子質量和質量分數是次要因素，在實際生產中，對主要因素選取使綜合平均值最好的水平，對次要因素可以選取使綜合平均值最好的水平，也可以選取細胞受毒害較小的水平進行最優(yōu)水平組合。用45%的PEG(Mr=2000)取代55%的PEG(Mr=4000)，同樣也得到了很高的融合率21.26%，而且對細胞的毒害更小，所以在生產實踐中較宜選用45%的PEG(Mr=2000)，而不是55%的PEG(Mr=4000)。

PEG介導細胞融合受很多因素的影響，只要控制好作用時間與溫度，將PEG的質量分數、相對分子質量等調節(jié)到適當的范圍，就能獲得較高的細胞融合率。當然，對于不同種類細胞，其最適融合條件之間的差別還有待于進一步研究探討。

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Astudyonconditionoptimizationofcell-fusionwithPEGastheRevulsant

YAN Zhen-jun1,ZHANG Xiao-bing2

(1.College of Life Sciences, Hubei Normal University, Huangshi 435002,China;2.Huangshi No.18 Middle School,Huangshi 435002,China)

The cell-fusion technique is a core basic technology,as the most frequently revulsant,PEG is widely used in many fields such as agriculture、medicine、environmental protection,and so on. To find a more effective and rapid cell-fusion method that can answer for the cell-engineering needs which need the fused cells to keep more physiological activities better, here, ox red cells were taken as the material, which were made to fuse induced by PEG, the author studied the effects of fusion temperature、PEG role time、PEG molecular weight and mass fraction on cell fusion.The results showed that when the fusion temperature、PEG role time、PEG molecular weight and mass fraction was 39℃、15min、2000、45%,respectively, the fusion frequency reached to the peak value at the same time that the poison to cells was much less，and the cell fusion rate reached to 21.26%.

cell engineering;PEG;the optimum use condition

2013—10—23

嚴鎮(zhèn)均(1976— )，男，湖北武漢人，講師，研究方向為遺傳學.

Q813.2

A

1009-2714(2014)01- 0014- 06

10.3969/j.issn.1009-2714.2014.01.004