都義日 杜雪江 于建設(shè)

·論著·

烏司他丁對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦水腫后NF-κB及IL-1β表達(dá)的影響

都義日 杜雪江 于建設(shè)

目的通過(guò)觀察大鼠創(chuàng)傷性腦水腫后腦組織中核轉(zhuǎn)錄子-κB(NF-κB)及白介素-1β(IL-1β)的變化，探討烏司他丁(UTI)在大鼠創(chuàng)傷性腦水腫過(guò)程中對(duì)腦組織的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法將30只健康成年SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、創(chuàng)傷性腦水腫組及UTI干預(yù)組，每組10只。并于傷后8、24、72采用免疫組化法及血清ELISA法檢測(cè)腦組織NF-κB和IL-1β的水平。結(jié)果創(chuàng)傷性腦水腫組和UTI組腦水腫部位NF-κB的活性和IL-1β的水平均較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，且于24 h達(dá)到最高值，于72 h時(shí)有所下降；UTI組各時(shí)間點(diǎn)與創(chuàng)傷性腦水腫組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論烏司他丁對(duì)大鼠創(chuàng)傷性腦水腫引起的腦損傷具有明顯的腦保護(hù)作用，通過(guò)抑制NF-κB和IL-1β信號(hào)傳導(dǎo)通路是烏司他丁腦保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。

烏司他丁 ；腦保護(hù)；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；白介素-1β

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)后，在原發(fā)的腦損傷的基礎(chǔ)上發(fā)生于細(xì)胞水平上的繼發(fā)性腦損害可造成難以逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)功能損害。包括興奮性損害、鈣平衡的改變、自由基損害、炎性反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等。其中炎性介質(zhì)是參與許多顱腦損傷后腦水腫形成的重要因素之一。因此，如何通過(guò)抑制炎癥介質(zhì)的釋放，減輕腦損傷后炎性反應(yīng)，從而降低神經(jīng)功能障礙的發(fā)生越來(lái)越多的受到關(guān)注。烏司他丁(Ulinastatin，UTI)作為一種蛋白酶抑制劑，研究表明，UTI可通過(guò)抑制NF-κB的活性來(lái)抑制炎性介質(zhì)的釋放，從而發(fā)揮腦保護(hù)作用[1]。本研究通過(guò)觀察大鼠創(chuàng)傷性腦水腫后腦組織中核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)及IL-1β的變化，探討UTI在大鼠創(chuàng)傷性腦水腫過(guò)程中對(duì)腦組織的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 選擇SD大鼠30只，雌雄不拘，體重300～350 g。按照隨機(jī)數(shù)字表分為正常對(duì)照組、創(chuàng)傷性腦水腫組及UTI干預(yù)組，每組10只。UTI治療組預(yù)先靜脈給予5×104U/kg ；其余兩組給予等量0.9%氯化鈉溶液。

1.2 模型制作 在室溫條件下，用戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉后，固定于腦立體定向儀上，頭頂剪毛，常規(guī)消毒。采用Marmarou等[2]創(chuàng)立的自由落體撞擊法制作。于大鼠麻醉后，切開(kāi)頭皮，暴露頂骨，以牙科樹(shù)脂將直徑10 mm、厚3 mm的金屬頭盔牢固粘于頂骨前、后囟之間。以450 g砝碼自1.5 m高度自由落下，建立創(chuàng)傷性腦水腫模型。

1.3 指標(biāo)的測(cè)定

1.3.1 腦組織NF-κB的測(cè)定：3組分別于傷后8、24、72 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)橫斷大鼠脊髓，取出腦組織并用4%多聚甲醛液固定后，梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸焟，常規(guī)石蠟包埋，切片。采用免疫組化染色檢測(cè)NF-κB活性。以水腫部位周?chē)麧{/胞核中出現(xiàn)棕色顆粒為陽(yáng)性細(xì)胞，并測(cè)定陽(yáng)性細(xì)胞的平均光密度值。

1.3.2 大鼠腦組織IL-1β水平測(cè)定：3組分別于傷后8、24、72 h3個(gè)時(shí)間點(diǎn)取0.2 ml腦組織勻漿上清液和血清，采用放射免疫法測(cè)定IL-1β。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)傷性腦水腫后各組NF-κB活性的影響 創(chuàng)傷性腦水腫組和UTI組腦水腫部位NF-κB的活性較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，且于24 h達(dá)高峰，于72 h時(shí)有所下降；在觀察的時(shí)間點(diǎn)里，UTI組各時(shí)間點(diǎn)均與創(chuàng)傷性腦水腫組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表1。

表1 創(chuàng)傷性腦水腫后3組NF-κB活性的變化

表1 創(chuàng)傷性腦水腫后3組NF-κB活性的變化

組別8h24h72h對(duì)照組0.057±0.0050.048±0.0060.061±0.007創(chuàng)傷性腦水腫組0.211±0.009*0.343±0.018*0.268±0.012*UTI組0.176±0.007*#0.250±0.010*#0.201±0.009*#

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與創(chuàng)傷性腦水腫組比較，#P<0.01

2.2 創(chuàng)傷性腦水腫后各組IL-1β水平 創(chuàng)傷性腦水腫組和UTI組腦水腫部位IL-1β水平較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，且于24 h達(dá)高峰；在觀察的時(shí)間點(diǎn)里，UTI組各時(shí)間點(diǎn)均與創(chuàng)傷性腦水腫組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 創(chuàng)傷性腦水腫后3組IL-1β水平的變化

表2 創(chuàng)傷性腦水腫后3組IL-1β水平的變化

組別8h24h72h對(duì)照組0.090±0.0070.085±0.0060.092±0.008創(chuàng)傷性對(duì)照組0.257±0.011*0.331±0.015*0.290±0.013*UTI組0.199±0.009*#0.228±0.012*#0.201±0.010*#

注：與對(duì)照組比較，*P<0.01；與創(chuàng)傷性腦水腫組比較，#P<0.01

3 討論

腦水腫是過(guò)多的水分積聚在腦實(shí)質(zhì)內(nèi)造成大腦腫脹的疾病，是顱腦損傷后較常見(jiàn)的繼發(fā)損傷。腦水腫引發(fā)的顱內(nèi)壓增高、腦疝將進(jìn)一步加重神經(jīng)功能損害，是顱腦損傷后治療的關(guān)鍵所在。傳統(tǒng)治療方法針對(duì)腦水腫主要干預(yù)措施是給予甘露醇等脫水或行去骨瓣減壓術(shù)[3]，但均存在不同程度的副作用。為了能夠達(dá)到靶點(diǎn)治療的目標(biāo)，研究人員著力于探討創(chuàng)傷性腦水腫的發(fā)生機(jī)制，并尋找到更有效而又副作用少的治療方法。

研究發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)傷性腦損傷后，損傷的部位浸潤(rùn)各種炎性細(xì)胞，并分泌大量的炎性細(xì)胞因子，繼而在炎性細(xì)胞因子的作用下：一方面作為保護(hù)性機(jī)制誘導(dǎo)神經(jīng)修復(fù)和重建的同時(shí)炎性細(xì)胞因子作為損害因素，進(jìn)一步加重腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞的損害，并引起一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)加重神經(jīng)系統(tǒng)的破壞。創(chuàng)傷性腦水腫的炎性反應(yīng)由一系列炎性細(xì)胞因子參與，其中包括IL-1β、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子(TNF-α)、熱休克蛋白(HSP)等。在白介素家族中，IL-1β與腦損傷關(guān)系最為密切。IL-1β是單核巨噬細(xì)胞合成和分泌的急性炎性因子，它通過(guò)促進(jìn)炎癥作用可激活腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞，促進(jìn)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的黏附而激發(fā)炎性反應(yīng)從而破壞血腦屏障[4]。IL-1β在腦損傷的早期就可以顯著升高，介導(dǎo)中性粒細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞滾動(dòng)、黏附、滲透并造成腦水腫和急性炎性反應(yīng)。在創(chuàng)傷性腦損傷后，NF-κB的激活、白介素和TNF-α的表達(dá)將共同參與并加重神經(jīng)系統(tǒng)功能的損害的過(guò)程[5，6]。

NF-κB是調(diào)控炎性介質(zhì)釋放的細(xì)胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB是目前發(fā)現(xiàn)的與炎癥有關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，是多種信號(hào)傳導(dǎo)途徑的匯聚點(diǎn)，在調(diào)節(jié)創(chuàng)傷性腦水腫后炎癥反應(yīng)中誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子和趨化因子的表達(dá)，并對(duì)多種關(guān)鍵酶的表達(dá)[7]具有重要的調(diào)控作用。靜息狀態(tài)下，NF-κB以非共價(jià)鍵結(jié)核的方式與其抑制因子I kB相結(jié)合，以無(wú)活性的形式存在于胞漿。在IL-1β、TNF-α、內(nèi)毒素等刺激因素作用下被激活后，NF-κB被磷酸化，并被蛋白酶水解，從而使NF-κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，并開(kāi)始啟動(dòng)和調(diào)控一系列細(xì)胞因子和黏附分子的表達(dá)[8]。與此同時(shí)，由NF-κB調(diào)節(jié)生成的產(chǎn)物如IL-1β、TNF-α、內(nèi)毒素等將繼續(xù)激活 NF-κB，從而形成級(jí)聯(lián)瀑布效應(yīng)。越來(lái)越多的研究證實(shí)NF-κB的激活是炎性介質(zhì)釋放后炎癥反應(yīng)失控的重要步驟[7-9]。因此，如何抑制NF-κB的激活成為阻止炎性反應(yīng)發(fā)生并引起一系列腦損傷的治療關(guān)鍵所在。

目前研究表明，如何在早期抑制細(xì)胞因子和有害物質(zhì)的生成是治療顱腦損傷的重點(diǎn)[8]。烏司他丁(UTI)作為一種蛋白酶抑制劑，近年來(lái)越來(lái)越多的被用于腦保護(hù)作用的研究當(dāng)中[9]。UTI主要通過(guò)清除氧自由基、抑制炎性反應(yīng)，免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮器官保護(hù)作用。本研究通過(guò)UTI治療創(chuàng)傷性腦水腫后發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷性腦水腫組和UTI組腦水腫部位NF-κB的活性和IL-1β的水平均較對(duì)照組明顯升高(P<0.01)，且于24 h達(dá)到較高值，于72 h時(shí)有所下降；在觀察的時(shí)間點(diǎn)里，UTI組各時(shí)間點(diǎn)均與創(chuàng)傷性腦水腫組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。說(shuō)明經(jīng)UTI治療組NF-κB活性和IL-1β的水平均較創(chuàng)傷性腦水腫組明顯降低。通過(guò)本研究發(fā)現(xiàn)UTI對(duì)NF-κB和IL-1β均具有明顯的抑制作用，進(jìn)而減輕炎性反應(yīng)、穩(wěn)定細(xì)胞膜，保護(hù)血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能，從而起到減少神經(jīng)系統(tǒng)的功能損害的作用。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)創(chuàng)傷性腦水腫后NF-κB和IL-1β水平的變化及UTI對(duì)其進(jìn)行干預(yù)后的影響的觀察，探討UTI對(duì)創(chuàng)傷性腦水腫后炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)UTI可通過(guò)抑制NF-βB表達(dá)，進(jìn)一步抑制炎性細(xì)胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等的表達(dá)，從而有效的保護(hù)腦細(xì)胞，減輕腦水腫，顯著減輕繼發(fā)性腦損傷，并為創(chuàng)傷性腦水腫的臨床治療提供了新思路。

1 陳偉峰，劉德紅，何衛(wèi)平，等.烏司他丁對(duì)大鼠全腦缺血再灌注后NF-κB 的影響.廣西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2006，9:11-14.

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9 于熙,田國(guó)剛,田毅.烏司他丁的腦保護(hù)作用研究進(jìn)展.海南醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010,16 ：948-950.

Effect of ulinastatin on the expression of nuclear factor-κB and interleukin-1β in rats with traumatic encephaledema

DUYiri,DUXuejiang,YUJianshe.DepartmentofAnesthesia,AffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010050,China

ObjectiveTo observe the changes of expression levels of nuclear factor-κB (NF-κB) and interleukin-1β (IL-1β) in rats with traumatic encephaledema in order to explore the protective effect and possible action mechanism of ulinastatin(UTI).MethodsThirty healthy adults SD 30 rats were randomly divided into three groups:normal control group,traumatic encephaledema group and UTI intervention group.The levels of NF-κB and IL-1β in serum and brain tissue homogenate (BTH) were detected by immunohistochemisty and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) at the 8th,12th,24th,72th hour after trauma.ResultsThe levels of NF-κB and IL-1β in encephaledema position were significantly increased,as compared with those in control group (P<0.01),which reached peak at the 24th hour,however,which reduced slightly at the 24th hour;there were significant differences in the changes of levels of NF-κB and IL-1β in every time point between UTI group and traumatic encephaledema group(P<0.01).ConclusionUTI has obvious protective effect on the brain injury caused by traumatic encephaledema in rats,it may be one of the action mechanisms to inhibit the signal transduction way of NF-κB and IL-1β.

ulinastatin;protection brain；NF-κB ;interleukin-1β

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.07.006

項(xiàng)目來(lái)源：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)青年基金資助項(xiàng)目(編號(hào)：NY2011QN004)

010050 呼和浩特市，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院麻醉科

R 742

A

1002-7386(2014)07-0981-03

2013-10-25)