張陽陽，戴立勝，周 乾，岳 媛，朱亞南，王 帥，徐芳芳，付 瑤，張嘉保

(吉林大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，吉林 長春 130062；吉林大學(xué) 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，長春 130062)

Micro RNA(miRNA)是一類具有組織特異性或發(fā)育階段特異性表達(dá)特征的非編碼調(diào)控小RNA，大小為18～24 nt，具有非常重要的生物學(xué)意義。miRNA主要通過基因切割和翻譯抑制的方式調(diào)節(jié)mRNA的翻譯或穩(wěn)定性，調(diào)控前體細(xì)胞系的增殖和器官的發(fā)生，miRNA通過與靶基因mRNA的種子區(qū)相結(jié)合，在生物的生長發(fā)育、組織分化及疾病發(fā)生等過程中起重要的作用，這使得miRNA逐漸成為新的研究熱點(diǎn)[1～5]。

miR-378在各臟器組織中均有表達(dá)，作用廣泛，主要與細(xì)胞凋亡和血管發(fā)生有關(guān)。已有研究表明，小鼠miR-378促進(jìn)小鼠成肌細(xì)胞增長[6]，并通過靶向調(diào)控GalNT7增強(qiáng)腎連蛋白糖基化從而促進(jìn)小鼠成骨細(xì)胞分化[7]。人miR-378靶向調(diào)控Sufu 和Fus-1促進(jìn)細(xì)胞存活、腫瘤生長及血管發(fā)生[8]。miR-378作用廣泛，與多種基因存在靶向作用。因此，本研究分析miR-378在牛各組織器官中的表達(dá)情況，檢測(cè)其靶作用基因，探究其作用機(jī)理，充實(shí)牛繁殖育種機(jī)理理論基礎(chǔ)，為提高牛各項(xiàng)生產(chǎn)性狀提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

在當(dāng)?shù)剡x定實(shí)驗(yàn)用西門塔爾牛，待被選個(gè)體被屠宰時(shí)，迅速取出睪丸、垂體、肺臟、肝臟、腎臟、大腦、腸系膜脂肪、小腸、脾臟組織于液氮中臨時(shí)保存，隨后保存于-80 ℃冰箱中備用。大腸桿菌感受態(tài)DH5α由實(shí)驗(yàn)室制備。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

從-80 ℃冰箱取出各組織樣品，分別取50 mg，根據(jù)Trizol一步法提取總RNA，經(jīng)1%的瓊脂糖電泳鑒定其質(zhì)量，并用Nanodrop測(cè)量其濃度。根據(jù)RT-PCR試劑盒(toyobo)內(nèi)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，根據(jù)頸環(huán)反轉(zhuǎn)錄引物5′GTCGTAATCCAGTGCGTGT CGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACG CCTTCT3′制備miR-378 cDNA第一鏈，置于-20 ℃冰箱備用。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR分析

針對(duì) miR-378特異性序列，設(shè)計(jì)上下游引物(上游引物：5′GGGACTGGACTTGG AGTCA3′下游引物：5′GTGCGTGTCGTGGAG TCG3′)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR。采用U6為內(nèi)標(biāo)基因，內(nèi)標(biāo)基因與目的基因各設(shè)3個(gè)平行反應(yīng)管。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)(TaKaRa)試劑盒，反應(yīng)條件采用三步法，95 ℃預(yù)變性 15 s，95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，40個(gè)循環(huán)。相對(duì)表達(dá)量數(shù)值通過2-ΔΔCt進(jìn)行計(jì)算。

1.2.3 靶基因重組雙熒光素酶報(bào)告載體構(gòu)建

根據(jù)TargetScan網(wǎng)站(http://www.targetscan.org/)及RNA22網(wǎng)站(http://cbcsrv.watson.ibm.com/rna22.html)等預(yù)測(cè)出miR-378候選靶基因。根據(jù)NCBI上候選靶基因SLC26A9成熟序列，選取其3′UTR上包含與miR-378結(jié)合位點(diǎn)序列，根據(jù)XhoⅠ和NotⅠ限制性酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。退火合成靶序列克隆至雙熒光素酶報(bào)告載體中。候選靶基因重組質(zhì)粒的突變，在與種子區(qū)結(jié)合位點(diǎn)設(shè)計(jì)4個(gè)堿基突變，引物設(shè)計(jì)見表1。

表1 候選靶基因種子區(qū)擴(kuò)增引物

1.2.4 雙熒光素酶報(bào)告分析

用DMEM高糖基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Hyclone)加入10%胎牛血清，1%雙抗于96孔板中培養(yǎng)NIH3T3細(xì)胞，將5pmol miR-378 或miR-NC mimics(吉瑪公司)與2 ng靶基因雙熒光素酶報(bào)告重組質(zhì)?；蚩蛰d體，用LipofectamineTM 2000共同轉(zhuǎn)染入NIH3T3細(xì)胞中。48 h后每孔用20 μL裂解液(PLB)，15 min搖床充分裂解后，加入Luciferase Assay Substrate及Stop&Glo? Substrate，化學(xué)發(fā)光儀設(shè)定檢測(cè)程序進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛各組織樣品總RNA提取

觀察瓊脂糖凝膠電泳中睪丸、垂體、肺臟、肝臟、腎臟、大腦、小腸、脾臟組織總RNA(圖1)，28 S、18 S、5 S三條帶清晰無雜帶，并測(cè)得總RNA濃度均在300 ng/μL～500 ng/μL之間，且A260/280均在1.8～2.0之間，總RNA質(zhì)量良好，可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 牛各組織RNA瓊脂糖凝膠電泳成像圖

2.2 牛各組織樣品實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR獲得的數(shù)據(jù)用Realplex軟件進(jìn)行分析。如圖2所示，miR-378在牛大腦、小腸、脾臟表達(dá)量相對(duì)較高，分別約為肝臟的4倍、4.5倍及8倍。而在睪丸、垂體中表達(dá)量相對(duì)較少，僅分別約為肝臟的0.1倍及0.2倍。由此可推測(cè)，miR-378對(duì)牛脂肪、小腸、脾臟的功能具有一定調(diào)節(jié)作用。

2.3 miR-378靶基因生物信息學(xué)分析

通過TargetScan、RNA22網(wǎng)站預(yù)測(cè)出多個(gè)靶基因，其功能作用各不相同，詳見表2。

圖2 牛各組織miR-378相對(duì)表達(dá)水平

表2 miR-378靶基因生物信息學(xué)分析

2.2 miR-378靶基因雙熒光素酶報(bào)告分析

在預(yù)測(cè)miR-378候選靶基因的過程中，驗(yàn)證出SLC26A9基因，其3′UTR種子區(qū)上有與miR-378互補(bǔ)結(jié)合的成熟序列AGTCCAG。為了驗(yàn)證其是否為miR-378的靶基因，我們克隆了psi-CHECK-DDAH1重組質(zhì)粒。已有發(fā)現(xiàn)miR-378靶基因MAPK1，在此作為陽性對(duì)照[9]。把SLC26A9重組質(zhì)粒、空白質(zhì)粒、陽性對(duì)照質(zhì)粒分別與miR-378或miR-NC mimics 共同轉(zhuǎn)染入NIH3T3細(xì)胞系中，48 h后進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告分析(見圖3)，可見miR-378下調(diào)SLC26A9的海腎熒光素酶與螢火蟲熒光素酶的表達(dá)比例差異極顯著(P<0.01)。與陽性對(duì)照對(duì)比，可以驗(yàn)證SLC26A9為miR-378靶基因。

圖3 靶基因體外雙熒光素酶報(bào)告(p<0.01)

3 討論

本研究主要通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-378在牛各內(nèi)臟中的組織相對(duì)表達(dá)水平，并利用雙熒光素酶報(bào)告驗(yàn)證牛miR-378靶基因SLC26A9，進(jìn)一步探究牛miR-378的作用機(jī)制。

miRNA通過對(duì)基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控而介導(dǎo)了一個(gè)全新層次上的基因表達(dá)調(diào)控方式。已有研究證實(shí)，miRNA參與血管發(fā)生、細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡等生命過程中的一系列重要進(jìn)程，且與動(dòng)物生長、繁殖、腫瘤疾病等密切相關(guān)，可見其在動(dòng)物生長發(fā)育過程中的重要性。已有報(bào)道，miR-378與細(xì)胞生長、細(xì)胞分化、腫瘤細(xì)胞存活、血管發(fā)生等密切相關(guān)[6～8]，對(duì)動(dòng)物生長發(fā)育意義重大，但在牛上研究較其他物種相對(duì)較少。本研究分析了miR-378在牛各組織相對(duì)表達(dá)水平及靶作用基因，為其在牛上發(fā)揮作用機(jī)制提供理論依據(jù)。

在miR-378靶基因預(yù)測(cè)過程中分析出候選靶基因，其中SULF1、SOX7、IGF1同對(duì)腫瘤細(xì)胞發(fā)揮作用，SULF1通過抑制heparin-binding生長因子信號(hào)抑制食管鱗狀癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的增殖與入侵[10，11]。SOX7抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路活性，抑制肺癌細(xì)胞和子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞[12，13]。IGF1與細(xì)胞生長及增殖有關(guān)，通過miR-486靶向調(diào)控，抑制肺癌細(xì)胞[14，15]。一種miRNA可調(diào)控多個(gè)靶基因，一個(gè)基因也同時(shí)可以被多個(gè)miRNA調(diào)控，如果把miR-378與SULF1、SOX7、IGF1聯(lián)系來，共同分析作用機(jī)理，可進(jìn)一步研究對(duì)腫瘤發(fā)生與抑制的作用機(jī)理，并深化了對(duì)miR-378對(duì)各組織癌細(xì)胞作用機(jī)制的研究。

本實(shí)驗(yàn)分析了miR-378在牛各組織分布及其靶基因檢測(cè)，為探究牛miR-378功能作用機(jī)制提供一定理論依據(jù)，具體miR-378在牛各組織功能作用機(jī)制需進(jìn)一步探究。

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