張 帆，李曉麗，王 俊，齊裕龍，張永根*

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.遼寧省葫蘆島市連山區(qū)動物疫病預(yù)防控制中心 125001；3.浙江省天臺縣畜牧獸醫(yī)局 317200；4.黑河市愛輝區(qū)畜牧獸醫(yī)局 164300)

杜泊綿羊黑頭白軀，體軀成桶形，肌肉發(fā)達(dá)，后軀豐滿，耐粗飼且對低品質(zhì)牧草利用率高[1]，具有較大的經(jīng)濟(jì)效益。但群體規(guī)模始終較小，主要原因就在于自然繁殖生產(chǎn)較慢。本研究旨在優(yōu)化杜泊綿羊超排方案，找到FSH合適劑量，提高杜泊羊群體擴(kuò)繁速度，探討重復(fù)超排及季節(jié)因素對超排效果的影響，為降低生產(chǎn)成本、提高杜泊羊繁殖效率提供依據(jù)。

胚胎移植是胚胎生物技術(shù)的重要組成部分，可充分發(fā)揮優(yōu)秀母畜在家畜品種改良和群體擴(kuò)繁中的潛力，使優(yōu)秀種畜基因高效地保留和遺傳下去[2，3]。有效縮短繁殖時(shí)間，快速擴(kuò)大種群規(guī)模。澳大利亞等國家已普遍在育種工作中采用超數(shù)排卵和胚胎移植技術(shù)，并已取得了顯著效果[3]。Robinson等[4]在1965年采用含有孕酮的海綿栓陰道埋植法進(jìn)行同期發(fā)情取得成效，隨后這一技術(shù)開始在生產(chǎn)上應(yīng)用。國內(nèi)，綿羊的同期發(fā)情研究始于20世紀(jì)70年代，張儒學(xué)于1980年用結(jié)合FSH和LH的甲孕酮陰道海綿栓進(jìn)行了綿羊同期發(fā)情試驗(yàn)，同期發(fā)情率100%、受胎率78%。綿羊同期發(fā)情技術(shù)在20世紀(jì)90年代趨于成熟，埋植裝置陰道孕酮釋放法的出現(xiàn)更為這一技術(shù)的大面積推廣與應(yīng)用提供了平臺[5，6]。目前，雖然綿羊超排的方法應(yīng)用已較廣泛，但由于綿羊妊娠涉及胚胎和母體子宮間妊娠信號的建立、附植的發(fā)生和胎盤的形成等一系列生理、生化過程[7]，導(dǎo)致其可用胚數(shù)量少，每只供體平均只有4枚左右[8]。 杜泊綿羊的胚胎移植也存在超排效果不穩(wěn)定、受精率低的制約。因而本研究旨在生產(chǎn)條件下，對杜泊綿羊按不同超排方案、不同F(xiàn)SH劑量、重復(fù)超排處理、比較不同季節(jié)及不同側(cè)移植效果，為篩選出適合生產(chǎn)應(yīng)用的超排技術(shù)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)動物及藥械

1.1.1 試驗(yàn)用羊及飼養(yǎng)管理

選取體重在65～80 kg，健康、繁殖機(jī)能正常的經(jīng)產(chǎn)母羊做供體；受體母羊年齡為1～4歲，膘情良好、健康，體重在50 kg以上。試驗(yàn)前期精細(xì)管理并進(jìn)行補(bǔ)飼。采精公羊?yàn)轲B(yǎng)殖場純種公羊，性欲良好，精液品質(zhì)優(yōu)良。試情公羊?yàn)樾杂⒌某赡旯颉?/p>

1.1.2 激素藥品

促卵泡素(FSH)、促黃體素(LH)、孕馬血清促性腺激素(PMSG)：寧波三生藥業(yè)有限公司產(chǎn)；陰道栓(CIDR)：新西蘭產(chǎn)EAZI-BREED-CIDR，20個(gè)/袋；Holding培養(yǎng)液：新西蘭生產(chǎn)，50 mL/袋。

1.1.3 設(shè)備及器械

外科手術(shù)器械、手術(shù)保定架、體視顯微鏡、檢卵針、沖卵管、移植槍、實(shí)體顯微鏡、恒溫臺等。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 供體羊超排處理和配種

CIDR+FSH+PMSG注射法：杜泊供體羊發(fā)情周期內(nèi)任意一天陰道放入CIDR，此后第10天開始注射FSH，每隔12 h注射FSH且劑量遞減，至第12天，取出CIDR后注射PMSG。超排羊在停止注射激素后24～48 h內(nèi)發(fā)情，公羊試情，間隔6～12 h再試情1次，直至不接受交配為止，并在第2次試情后注射LH 110 IU/只。受體羊同步試情處理。

CIDR+FSH+PG注射法：杜泊供體羊發(fā)情周期內(nèi)任意一天陰道放入CIDR，此后第10天開始注射FSH，每隔12 h一次，等劑量，在第12天時(shí)取出CIDR后注射PG。超排羊在停止注射激素后24～48 h內(nèi)發(fā)情，公羊試情，間隔6～12 h再試情1次，直至不接受交配為止，并在第2次試情后注射LH 110 IU/只。受體羊同步試情處理。

采用開膣器輸精+自然交配+開膣器輸精方式，人工采集種公羊精液，鏡檢，活率達(dá)0.6以上方可用于人工輸精。

1.2.2 胚胎質(zhì)量鑒定

配種后第5天手術(shù)法從子宮角沖卵，在20～40倍體式顯微鏡下根據(jù)受精卵的形態(tài)、色澤、分裂球的大小和數(shù)量、均勻度、細(xì)胞的密度及變化情況確定受精卵發(fā)育期、未受精卵及胚胎發(fā)育階段。

1.2.3 受體處理與腹腔內(nèi)窺鏡法胚胎移植

使用CIDR+PMSG法，與供體羊同步埋植CIDR，在供體羊撤栓前10 h撤除CIDR，注射280 IU PMSG。試情如前所述，詳細(xì)記錄發(fā)情時(shí)間。

采用腹部手術(shù)法處理受體羊，腹腔內(nèi)窺鏡觀察，單側(cè)卵巢1～3個(gè)黃體則移植1～2枚胚胎。

1.2.4 供受體羊術(shù)后處理

供受體羊術(shù)后在小圈內(nèi)觀察1～2 d，圈舍應(yīng)保持清潔干燥，防止感染，保證術(shù)后恢復(fù)良好。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

使用spss18.0軟件對超排供體黃體數(shù)、可用胚胎數(shù)分別進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方案的超排效果

在表1中，采用不同搭配注射方式進(jìn)行超排，結(jié)果顯示，CIDR+ FSH + PMSG 的供體平均黃體數(shù)(11.80個(gè)/只)、平均沖卵數(shù)(9.20枚/只)、平均可用胚數(shù)(7.80/只)和移植妊娠率50.00%(P<0.05)，超排效果比CIDR+FSH+PG要好。

表1 不同超排方案的效果比較

注：表中數(shù)字肩標(biāo)字相同者，差異不顯著，P>0.05；不同者，差異顯著，P<0.05，大寫字母表示差異極顯著，下同。

2.2 不同劑量FSH的超排效果

按統(tǒng)一方案處理的45只杜泊供體綿羊中，在體重(60 kg以上)相近的情況下，按FSH的注射劑量范圍分為三組，140～180 IU組、180～230 IU組、230～280 IU組(見表2)。結(jié)果表明，180～230 IU組的平均黃體數(shù)、平均沖卵數(shù)、平均可用胚胎數(shù)和移植妊娠率分別為：12.87個(gè)/只、10.88枚/只、9.28枚/只和75.00%，無論是平均黃體數(shù)、平均獲卵數(shù)還是平均可用胚胎數(shù)、移植妊娠率都高于其他兩個(gè)FSH劑量組(P<0.05)。

表2 不同F(xiàn)SH劑量對杜泊綿羊超排效果的影響

2.3 重復(fù)超排的超排效果

表3顯示，2013年10月與2012年10月的結(jié)果比較差異不顯著(P>0.05)。對上一年使用過的30只羊重復(fù)超排，結(jié)果表明只要手術(shù)時(shí)注意操作方法，盡量減少出血點(diǎn)、適當(dāng)灌注含林可霉素的生理鹽水就可以減少甚至有可能避免粘連現(xiàn)象的發(fā)生，以利于羊只的重復(fù)使用，從而提高經(jīng)濟(jì)效益。

表3 重復(fù)超排對杜泊綿羊超排效果的影響

2.4 不同季節(jié)的超排效果

2013年春季、秋季(間隔6個(gè)月)兩次超排結(jié)果對比發(fā)現(xiàn)，秋季超排在平均黃體數(shù)、平均沖卵數(shù)、平均可用胚數(shù)上顯著高于春季，秋季胚胎移植妊娠率59.14%極顯著高于春季妊娠率38.16%(P<0.01)。

表4 不同季節(jié)對杜泊綿羊超排效果的影響

2.5 不同側(cè)卵巢移植的超排效果

統(tǒng)計(jì)50只供體左、右側(cè)卵巢平均黃體數(shù)、平均沖卵數(shù)、平均可用胚數(shù)差異不顯著(P>0.05)(見表5)，說明左、右側(cè)卵巢對超排反應(yīng)無差別。

表5 左右側(cè)卵巢對杜泊綿羊超排效果的影響

3 討論

3.1 不同超排方案的超排效果

超排方法對超排效果的影響包括超排藥物劑量、激素的不同種類及激素生產(chǎn)廠家的不同等，此前有報(bào)道國內(nèi)平均水平為5～7枚[9]，閻振富等[8]報(bào)道超排處理綿羊可用胚為6枚左右。魏建英等[10]研究報(bào)道杜泊羊采胚只均獲胚胎5.16枚。本研究的兩個(gè)超排方案獲胚數(shù)與此前國內(nèi)報(bào)道一致，兩種方法中，CIDR+FSH+PMSG法較為理想，CIDR中的孕酮被吸收進(jìn)入血液后提高血液孕酮濃度，足以抑制來自垂體前葉LH和FSH的釋放，撤掉CIDR后孕酮水平降低回歸基礎(chǔ)水平，刺激卵泡發(fā)育成熟排卵形成黃體，而此時(shí)注射PG的劑量和時(shí)間的掌握對黃體的發(fā)育有著極為重要的影響，刺激較大，而PMSG效果較為平緩，卵巢體積不會劇烈增大，處理后的卵巢容易恢復(fù)正常，排卵率高。

3.2 不同F(xiàn)SH劑量的超排效果

Renaville等[11]發(fā)現(xiàn)，超排效果與供體體況顯著相關(guān)，超排時(shí)單一、營養(yǎng)水平較低的飼養(yǎng)方式會導(dǎo)致黃體早期退化，造成胚胎退化甚至檢不到胚胎。即使配種前對供體催情補(bǔ)飼也不會提高排卵率，甚至使胚胎存活力降低。張金龍等[12]研究表明，營養(yǎng)水平較好(體重40～50 kg)的波爾山羊排卵效果最佳。PMSG由于其半衰期長，容易引起卵巢囊腫[13]，對劑量的正確使用要求較高，因而國內(nèi)外目前更傾向于使用FSH[14]。而FSH的使用劑量對綿羊超排效果有很大影響。有報(bào)道稱，供體FSH注射劑量的過低或過高會導(dǎo)致超排黃體少或卵泡過多，影響超排效果，但相同來源的激素在一定劑量范圍內(nèi)，超排效果隨劑量上升而有增大趨勢。對杜泊羊，國內(nèi)報(bào)道的FSH劑量區(qū)間126～ 150 IU，平均采集可用胚5.16枚[10]。過大的劑量會影響卵泡的發(fā)育和卵子的質(zhì)量。在體重相近的情況下，將FSH劑量為140～180 IU組、180～230 IU組、230～280 IU組三組，結(jié)果180～230 IU組效果最好，說明FSH注射劑量有一個(gè)適宜劑量，過低過高都將影響超排效果。

3.3 重復(fù)超排的超排效果

羊的生理解剖特點(diǎn)決定了無法直腸檢查，只能通過手術(shù)觀察子宮，這既加大了工作量，又易增大粘連發(fā)生的幾率。常用的腹腔鏡技術(shù)雖然對母羊生殖器官損傷小、減少手術(shù)刺激及盲目性等優(yōu)點(diǎn)，但對操作技術(shù)要求較高，且設(shè)備較昂貴。在實(shí)際生產(chǎn)上，優(yōu)質(zhì)種羊應(yīng)得到高效重復(fù)使用，這可以有效降低成本、提高羊只利用率，但手術(shù)造成的生殖器官黏連，嚴(yán)重制約沖胚效果。本研究對30只間隔12個(gè)月的杜泊綿羊進(jìn)行重復(fù)超排，其中有26只羊第2次超排采出胚胎，采胚成功率、平均黃體數(shù)、平均可用胚數(shù)與第1次比較無顯著差異(P>0.05)，且略有提高。分析可能原因，我們認(rèn)為一是采取了手術(shù)時(shí)嚴(yán)格消毒和防止粘連的措施；二延長了超排處理的時(shí)間間隔，使卵巢有充足的恢復(fù)時(shí)間。

3.4 不同季節(jié)、左右側(cè)移植的超排效果

本試驗(yàn)超排效果比較發(fā)現(xiàn)，在綿羊自然發(fā)情季節(jié)，秋季的效果明顯好于春季。張果平等[15]對杜泊羊進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，秋冬兩季的回收胚胎數(shù)顯著高于春季，這與本次試驗(yàn)結(jié)果相一致。但桑潤滋等[16]研究發(fā)現(xiàn)，波爾山羊在春、夏、秋三個(gè)季節(jié)的超排效果沒有差異，以秋季較好，這可能與品種間差異有關(guān)。不同側(cè)卵巢在激素處理后，結(jié)果表明，妊娠率無顯著差異(P>0.05)，說明移植效果與移植側(cè)沒有必然聯(lián)系，只于黃體質(zhì)量關(guān)系較大。

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