孟小蓉 包 勇 李 凱 曹 敏 紀(jì)風(fēng)兵

結(jié)核病是全球主要公共衛(wèi)生問題之一，嚴(yán)重危害人類健康。雖然近年來全球防控措施逐漸增強(qiáng)，但其龐大的患病基數(shù)、人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)感染率上升、多耐藥結(jié)核菌株增加等原因?qū)е陆Y(jié)核病的防控仍面臨嚴(yán)峻形勢[1]。世界衛(wèi)生組織(WHO)2012結(jié)核病報(bào)告顯示2011年全球新增結(jié)核病例870萬，死亡140萬[1]。診斷延遲是導(dǎo)致我國結(jié)核病防治工作進(jìn)度緩慢的最主要原因[2]。目前，傳統(tǒng)病原學(xué)檢測方法如抗酸桿菌涂片和結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)培養(yǎng)，存在敏感性低、特異性差、操作繁瑣、檢測周期長等缺點(diǎn)。聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)技術(shù)以其高敏感性、操作簡單快捷、不受環(huán)境和患者體質(zhì)及用藥影響等優(yōu)點(diǎn)在結(jié)核病早期診斷中具有優(yōu)越性，其中以能夠準(zhǔn)確定量、動(dòng)態(tài)監(jiān)測的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)最為常用。但是，該方法存在費(fèi)用高、特異性差、對底物模板濃度要求高等缺點(diǎn)，使其對于單位體積MTB微量的樣本敏感性更低，假陰性率升高。目前有學(xué)者將實(shí)時(shí)熒光定量PCR和巢式PCR兩種技術(shù)結(jié)合，即巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative nested real-time polymerase chain reaction, QNRT-PCR)，用于乙肝病毒、人T細(xì)胞白血病病毒、人乳頭瘤病毒等檢測，均證實(shí)其有效彌補(bǔ)了實(shí)時(shí)熒光定量PCR缺點(diǎn)，具有更好的臨床應(yīng)用價(jià)值[3-5]。目前尚無將此方法應(yīng)用于MTB DNA含量檢測的報(bào)道，本研究擬建立QNRT-PCR檢測MTB DNA方法，旨在探討其在結(jié)核病診斷中的臨床應(yīng)用價(jià)值。

材料與方法

一、實(shí)驗(yàn)材料

1. 樣本收集： 本研究自2012年6月至2013年10月，共采集24例肺結(jié)核患者痰液(取患者清晨漱口后留取晨痰于清潔痰杯中，1 h內(nèi)送檢)24份，25例結(jié)核性胸膜炎患者胸水(于胸腔穿刺后留取60 ml胸水于高壓滅菌玻璃瓶內(nèi)，立即分離，若不能立即分離樣本置于4 ℃保存，不超過72 h)27份，對照組痰和胸水共75份。所有病例均取自成都市第三人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科、成都市傳染病院以及成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院傳染病科[6-7]。 其中，肺結(jié)核的確診以痰培養(yǎng)為“金標(biāo)準(zhǔn)”。結(jié)核性胸膜炎為臨床診斷，診斷標(biāo)準(zhǔn)如下：①患者有結(jié)核中毒癥狀并伴有胸腔積液；②胸腔積液生化檢測為滲出液；③至少觀察抗結(jié)核治療1個(gè)月有效，胸腔積液未再復(fù)發(fā)；④排除其它性質(zhì)胸腔積液。

2.儀器試劑： 3.5熒光定量PCR儀(羅氏，瑞士)、PCR儀(Bio-RAD，美國)、低溫冷凍離心機(jī)(Thermo)、低速離心機(jī)(Thermo)、六一普通水平電泳儀(北京)、核酸蛋白分子成像儀(德國，Eppendorf)；細(xì)菌DNA提取試劑盒(全式金)、普通PCR試劑盒(全式金)、熒光定量PCR試劑盒(全式金)、針對特異結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群MPT64基因設(shè)計(jì)引物[8]，具體序列如下：外套上游引物(F-1): 5′-ATCCGCTGCCAGTCGTCTTCC-3′，外套下游引物(R-2):5′-CTCGCGAGTCTAGGCCAGCAT-3′，內(nèi)套上游引(F-2): 5′-CATTGTGCAAGGTGAACTGAGC-3′，內(nèi)套下游引物(R-2)：5′-AGCATCGAGTCGATCGCGGAA-3′由上海生物工程股份有限公司合成，擴(kuò)增片段分別為241 bp和201 bp。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. 標(biāo)本前處理及DNA提?。?取痰液0.5 ml或胸水60 ml，以2～8 ℃，離心半徑8 cm，12 000 r/min離心15 min，棄上清液；然后加生理鹽水500 μl，斡旋混勻，室溫下，以半徑離心8 cm，12 000 r/min離心3 min，棄上清液，重復(fù)三次，取沉淀物提取DNA或-20 ℃保存?zhèn)溆谩NA的提取采用細(xì)菌DNA提取試劑盒(全式金)，嚴(yán)格按照操作步驟進(jìn)行。

2. 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品： 以H37vRV標(biāo)準(zhǔn)菌株(由成都市第三人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)部保存提供)為模板，采用F-2、R-2內(nèi)套引物，進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為引物各0.6 μl，Mix 12.5 μl，模板2 μl，加ddH2O至25 μl體系，擴(kuò)增目的片段為201 bp，設(shè)置參數(shù)為94 ℃預(yù)變性3 min，然后94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min循環(huán)25次，72 ℃延伸10 min，反應(yīng)完成后取PCR產(chǎn)物于2%瓊脂糖凝膠電泳分析，在略大于200 bp處可見目的條帶，將目的條帶割膠回收與pGM-T載體連接，16 ℃過夜，并將連接液轉(zhuǎn)化入大腸桿菌αH5感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行氨芐抗生素篩選，再進(jìn)行搖菌擴(kuò)大培養(yǎng)，最后提取質(zhì)粒行PCR電泳和測序鑒定，紫外分光光度計(jì)測定鑒定正確質(zhì)粒OD260為0.5，OD260/OD280為1.83，根據(jù)公式：質(zhì)粒拷貝數(shù)濃度(拷貝/ml)=(質(zhì)量÷分子量)×6.02×1023，計(jì)算出質(zhì)?？截悵舛葹?.09×1012拷貝/ml，將其10倍系列稀釋成含有1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108copy/μl的6個(gè)梯度， 作為檢測MTB DAN的陽性參照定量標(biāo)準(zhǔn)品[8]。

3. 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立: 將7.09×1012拷貝/ml質(zhì)粒倍比稀釋后取7.09×102～7.09×109copy/μl的8個(gè)梯度，得到該方法在1×104～1×108拷貝/ml范圍內(nèi)，隨著起始模板量的減少，對應(yīng)的Ct值(每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù))相應(yīng)增大，兩者間呈線性關(guān)系，r=0.99，且溶解曲線呈單峰，見圖1。

注：A：擴(kuò)增曲線；B：標(biāo)準(zhǔn)曲線；C：溶解曲線

4. QNRT-PCR反應(yīng)體系及條件: QNRT-PCR反應(yīng)分兩步，第一步，采用Bio-RAD PCR儀，反應(yīng)體系為10 μl 2×PCR mix，引物F-1和R-1各0.16 μl，ddH2O 8.68 μl，模板(DNA提取物)2 μl，共20 μl體系，反應(yīng)條件為預(yù)變性94 ℃ 3 min，變性94 ℃ 30 s，退火62 ℃ 30 s，復(fù)性72 ℃ 1 min，循環(huán)15次，然后再72 ℃ 10 min，循環(huán)1次；第二步，采用3.5熒光定量PCR儀，反應(yīng)體系為2×qPCR mix 15 μl，enhancer 0.4 μl，引物F-2和R-2各0.2 μl，ddH2O 15 μl，模板為第一輪PCR反應(yīng)產(chǎn)物0.15 μl，共30 μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為熒光定量PCR兩步法，即預(yù)變性94 ℃ 3 min，循環(huán)1次，然后變性94 ℃ 30 s，退火62 ℃ 30 s，循環(huán)35次，溶解曲線溫度40～80 ℃。同時(shí)，所有樣本均進(jìn)行巢式PCR和熒光定量PCR方法檢測，定量PCR反應(yīng)條件同巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR第二步，巢式PCR反應(yīng)條件第一步同巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR，第二步為預(yù)變性94 ℃ 3 min，循環(huán)1次，變性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 30 s，復(fù)性72 ℃ 1 min，循環(huán)25次，最后再72 ℃ 10 min，循環(huán)1次。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0軟件分析，兩組計(jì)數(shù)資料分析采用卡方檢驗(yàn)，兩組均數(shù)間比較采用兩樣本比較t檢驗(yàn)，組內(nèi)兩種PCR檢測方法間的比較采用配對t檢驗(yàn)，P<0.05表示具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 患者的基本臨床特征

本研究共納入126例患者，其中肺結(jié)核24例，結(jié)核性胸膜炎滲出性27例，對照組病例主要為普通細(xì)菌性肺炎、肺真菌病、惡性胸腔積液、漏出性胸腔積液。所有患者的臨床信息，包括年齡、性別、結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)和涂片、病理組織學(xué)、胸部影像學(xué)結(jié)果等，見表1。

表1 患者臨床資料

二、QNRT-PCR特異性、敏感性、重復(fù)性

以痰培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌陽性肺結(jié)核確診標(biāo)準(zhǔn)，檢測24份來自肺結(jié)核患者的痰MTB DNA，結(jié)果敏感性、特異性、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值分別為95.83%、61.54%、69.70%和94.12%；以內(nèi)科胸腔鏡胸膜活檢的組織病理學(xué)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，巢式實(shí)時(shí)熒光定量PCR敏感性和特異性分別為75%和100%； 另外，所有檢測結(jié)果至少重復(fù)2次，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果無差異(P<0.05)，重復(fù)性好，見表2。

表2 QNRT-PCR診斷性能

QNRT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、巢式PCR三種方法檢測結(jié)果比較陽性率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，QNRT-PCR的敏感性最高；且兩種定量PCR檢測結(jié)果比較，QNRT-PCR的 Ct值較小，見表3。

表3 三種PCR方法比較

三、QNRT-PCR在結(jié)核性胸膜炎的臨床應(yīng)用

本研究進(jìn)一步將QNRT-PCR用于胸水中MTB DNA的檢測。結(jié)果顯示：在27例臨床診斷結(jié)核性胸膜炎患者中，該方法檢測陽性率達(dá)70.37%，明顯高于單獨(dú)采用熒光定量PCR及巢式PCR的陽性率66.67%及11.11%。

討 論

QNRT-PCR是一種新的PCR技術(shù)，是在巢式PCR和定量PCR基礎(chǔ)上改進(jìn)和創(chuàng)新的技術(shù)。在結(jié)核病的診斷中，有日本學(xué)者先后于2006年、2008年兩次報(bào)道應(yīng)用該方法檢測腦脊液中MTB DNA，敏感性和特異性分別為95.8%、100%，但樣本例數(shù)僅有25例[10]。本研究首次以痰和胸水為樣本，評價(jià)了QNRT-PCR在肺結(jié)核和結(jié)核性胸膜炎診斷中的檢驗(yàn)性能，同時(shí)增加樣本量及樣本類型。

眾所周知，傳統(tǒng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)常用于臨床樣本的感染性病原體DNA定性和/或定量檢測，但極少用于MTB DNA的準(zhǔn)確定量[11-14]。因此，本研究以結(jié)核分枝桿菌MPT64基因部分序列為目的片段進(jìn)行了分子克隆，構(gòu)建了標(biāo)準(zhǔn)品，能準(zhǔn)確定量底物模板中的拷貝數(shù)，并以培養(yǎng)為金標(biāo)準(zhǔn)，共檢測了50份痰樣本。QNRT-PCR敏感性高達(dá)95.83%，明顯高于本研究中同步進(jìn)行的實(shí)時(shí)熒光定量PCR 40%的敏感性，且前者Ct值的均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差更小。分析其可能的原因有: ①本研究采用了本實(shí)驗(yàn)室新的細(xì)菌DNA提取方法，提高了DNA的提取效率；②MPT64基因被認(rèn)為MTB最敏感和特異的序列[8]，以其合成特異的引物有利于提高PCR擴(kuò)增效率；③在定量PCR中，本研究運(yùn)用高敏感性的SYBR Green染料法；④最重要的是，該方法中巢式PCR技術(shù)的應(yīng)用，同傳統(tǒng)的一步實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)相比較，進(jìn)一步提高了檢測的敏感性和特異性。

在26份培養(yǎng)陰性的痰標(biāo)本中，QNRT-PCR檢測陽性10例(38%)。與此不同的是2例病理組織學(xué)陰性的痰標(biāo)本QNRT-PCR結(jié)果都呈陰性；另一方，本研究同時(shí)對MTB、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎克雷伯桿菌、金黃色葡萄球菌、屎腸球菌、白色念珠菌共5株標(biāo)準(zhǔn)菌株的DNA進(jìn)行檢測，除MTB外，其它菌株及陰性對照Ct值>35或未擴(kuò)增，再行瓊脂糖凝膠電泳顯示僅有MTB菌株樣本在201 bp處見清晰條帶，其它菌株及陰性對照結(jié)果均呈陰性。因此，本研究中較高的假陽性可能與MTB培養(yǎng)-即“金標(biāo)準(zhǔn)”本身敏感性低有關(guān)。另外，臨床樣本的混合性、復(fù)雜性，也有可能是影響PCR擴(kuò)增結(jié)果的因素。

由于發(fā)病機(jī)制的原因，結(jié)核性胸膜炎的病原學(xué)診斷一直是個(gè)難題，胸水MTB培養(yǎng)敏感性僅有10%～35%[14]。在本研究中，共檢測27例臨床診斷結(jié)核性胸膜炎患者的27份胸水，QNRT-PCR、實(shí)時(shí)熒光定量PCR、巢式PCR、陽性率分別為74.37%、66.67%、11.11%。結(jié)果表明，針對胸水這種少量MTB樣本特性，QNRT-PCR具有明顯的優(yōu)越性。

QNRT-PCR檢測是一種合并巢式PCR高敏感性和實(shí)時(shí)熒光定量PCR動(dòng)態(tài)監(jiān)測、準(zhǔn)確定量的新技術(shù)，進(jìn)一步提高了其檢測的特異性、增加了檢測樣本量及樣本類型，將有利于臨床結(jié)核病的診斷。

參 考 文 獻(xiàn)

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