劉慈 劉義輝 劉學(xué)軍 王振海 張曉艷 辛虹

·論著·

羊水細胞培養(yǎng)用于染色體病產(chǎn)前診斷分析

劉慈 劉義輝 劉學(xué)軍 王振海 張曉艷 辛虹

目的探討羊水細胞培養(yǎng)對孕中期孕婦進行產(chǎn)前診斷的可行性及必要性，防止染色體病患兒的出生。方法對293例有產(chǎn)前診斷指征的孕婦進行羊膜腔穿刺，采取羊水細胞培養(yǎng)，制備中期染色體，分析胎兒核型，進行產(chǎn)前診斷。結(jié)果發(fā)現(xiàn)染色體異常14例，異常率4.78%，其中數(shù)目異常9例，結(jié)構(gòu)異常5例，不同產(chǎn)前診斷指征分組中的異常率不同，以夫婦一方為染色體異常組異常率最高。結(jié)論妊娠中期對有產(chǎn)前診斷指征的孕婦進行羊水細胞培養(yǎng)染色體核型分析是產(chǎn)前診斷的重要手段，而血清學(xué)篩查，染色體檢查和超聲檢查三者相互結(jié)合對于預(yù)防出生缺陷意義重大。

染色體；核型；胎兒；羊膜腔穿刺；產(chǎn)前診斷

隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展以及人們對優(yōu)生優(yōu)育的高度重視，染色體疾病的產(chǎn)前診斷技術(shù)得到了迅速提高，其中包括胎兒羊水、臍血、絨毛細胞培養(yǎng)及熒光原位雜交(FISH)等。羊膜腔穿刺術(shù)經(jīng)多次改進，目前已成為國內(nèi)外公認的安全、簡便、經(jīng)濟的產(chǎn)前診斷取材方法。國內(nèi)外對染色體病的產(chǎn)前診斷仍以羊水染色體檢查為主。本文就河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院293例產(chǎn)前診斷對象的羊水細胞培養(yǎng)及染色體結(jié)果進行分析，報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年3月至2012年12月河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院產(chǎn)科及遺傳咨詢門診有產(chǎn)前診斷指征的孕婦，年齡19～46歲，孕周為18～25周，共293例。按照孕婦進行產(chǎn)前檢查的首要原因，將孕婦依次分成6類。其中孕婦產(chǎn)前篩查高風(fēng)險107例，高齡孕婦106例，超聲檢查提示胎兒異常者47例，夫婦雙方一方染色體異常者5例，有21三體或其他染色體病患兒生育史的23例，其他原因者5例(包括孕早期用藥史、有害物質(zhì)接觸史等)

1.2 方法 細胞培養(yǎng)：在妊娠18～25周進行羊膜腔穿刺，B超定位即尋找無胎體的最深羊水池位置，常規(guī)無菌消毒，在超聲實時監(jiān)測下經(jīng)腹壁穿刺，抽取羊水20～30 ml，置無菌離心管中，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，留取1 ml羊水及沉淀細胞，置于5 ml羊水完全培養(yǎng)基(AminoMAXTM-II Complete，GIBCO)中，37℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一般在第7天換液，先在倒置顯微鏡下觀察，如有多個中小克隆，即可吸出原來培養(yǎng)液加入新培養(yǎng)基5 ml即換液，并將原液加入另一新的培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)，以備復(fù)查。一般換液后再培養(yǎng)24 h即可收獲，此時細胞生長旺盛，倒置顯微鏡下觀察，有較多圓形透亮細胞。但由于存在個體差異，個別羊水細胞狀態(tài)不好的，換液后可培養(yǎng)48 h后再收獲。

收獲：加入秋水仙素，終濃度為0.1 μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)5～6 h，鏡下觀察有大量圓形細胞即可終止培養(yǎng)。用0.25%trypsin-EDTA消化3 min左右，2 000 r/min離心10 min，棄上清液，加入0.075 mol/L KCl低滲7 min，并用3∶1甲醇冰醋酸預(yù)固定和固定后，滴片，常規(guī)G顯帶。每例計數(shù)20～30個分裂相，每例分析5個核型。

2 結(jié)果

2.1 不同產(chǎn)前診斷指征中的染色體異常分布 本組檢出的14例染色體異常中，高齡組5例占35.71%(5/14)，均為非整倍體；唐氏高危組2例占14.29%(2/14)，其中1例為21-三體，1例為結(jié)構(gòu)異常；不良孕產(chǎn)史(包括21-三體分娩史)組1例占7.14%(1/14)，為染色體結(jié)構(gòu)異常；夫婦一方染色體異常組3例占21.43%(3/14)，均為結(jié)構(gòu)異常；超聲檢查異常組3例占21.43%(3/14)，均為數(shù)目異常。14例染色體異常中，染色體數(shù)目異常共9例，其中常染色體數(shù)目異常8例(8例47，Xn，+21，1例47，XX，+18)，性染色體數(shù)目異常1例(45，XO)，均選擇孕中期引產(chǎn)；染色體結(jié)構(gòu)異常5例，均足月分娩，隨訪表型正常。見表1。

表1 14例染色體異常胎兒相關(guān)臨床資料

2.2 胎兒染色體異常檢出率與不同產(chǎn)前診斷指征的關(guān)系 293例孕婦中胎兒染色體異常檢出14例，檢出率為4.78%。夫婦一方染色體異常組胎兒染色體異常檢出率最高，比率達到60%，與高齡組、唐氏高危組、不良孕產(chǎn)史組間比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高齡組、唐氏高危組、不良孕產(chǎn)史組和超聲檢查異常組染色體異常檢出率間兩兩比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 不同產(chǎn)前診斷指征分組中胎兒染色體異常檢出率比較 例

3 討論

染色體病是導(dǎo)致新生兒出生缺陷的重要原因之一，可以通過產(chǎn)前診斷預(yù)防缺陷兒的出生。由于羊水檢查是在孕中期進行，取材操作簡單安全、細胞培養(yǎng)相對成功率高，發(fā)現(xiàn)異?？杉皶r終止妊娠。

方群等[1]研究發(fā)現(xiàn)，具有產(chǎn)前診斷指征的高危孕婦胎兒染色體異常檢出率為3.8%～7.7% 。本研究胎兒染色體異常檢出率為4.78%，與文獻報道相近，均高于一般人群染色體異常發(fā)生率0.5%[2]。

3.1 高齡及唐氏篩查高危與胎兒染色體異常的診斷 本研究發(fā)現(xiàn)年齡≥35歲的孕婦中發(fā)生非整倍體的概率為4.72%(5/106)，而年齡<35歲者則僅為1%[3]。因此對于35歲以上的高齡孕婦，羊膜腔穿刺時一項必不可少的檢查。

據(jù)報道，胎兒唐氏綜合征的發(fā)病只有15%～31%是發(fā)生在35歲以上孕婦，而69%～85%是發(fā)生在小于35歲的孕婦[3]。在我國生育高峰在35歲以下，所以唐氏綜合征的血清學(xué)篩查也很重要。但目前各個醫(yī)院所用的篩查指標和篩查軟件不盡相同，篩查的假陽性率相當高，假陰性率也時有發(fā)生，故迫切需要一種特異性較高的篩查方法。本研究發(fā)現(xiàn)，唐氏高危組胎兒染色體異常檢出率為1.87% (2/107)，與文獻[4]報道的1.3%相近。

本研究中，唐氏高危組發(fā)現(xiàn)2例胎兒染色體異常，1例為21-三體，另1例為平衡易位：46,XX,t(2;15)(q13;q15)(生后隨訪未發(fā)現(xiàn)表型異常)。

3.2 B超檢查與胎兒染色體異常的診斷 超聲檢查方法簡便、無創(chuàng)、迅速，是產(chǎn)前診斷不可缺少的手段之一。異常超聲波對產(chǎn)前診斷意義重大，胎兒外觀異常，往往提示胎兒染色體有異常的可能。本文47例超聲異常病例中，胎兒染色體異常率為6.38%(3/47)。在檢出的3例羊水染色體異常病例中，均有2個或更多部位的發(fā)育異常，且均是數(shù)目異常47,XX,+18，45,XO，47,XY,+21。胎兒2個或多個部位發(fā)育異常較1個部位發(fā)育異常更能明顯提示胎兒染色體異常，其幾率由2%上升至21%[5]。Verdin等[6]報道母體血清篩查陰性的孕婦，胎兒超聲波數(shù)據(jù)異常提示胎兒染色體異常的風(fēng)險增加，如果超聲篩查正常，則胎兒染色體非整倍體的風(fēng)險減低至0.6%。B超檢測不僅與檢測儀器相關(guān)，B超醫(yī)生的經(jīng)驗也非常重要。故我們認為對母體血清篩查陰性的孕婦，超聲檢測胎兒存在2個或多個部位發(fā)育異常具有產(chǎn)前診斷意義。

3.3 胎兒染色體異常及其相關(guān)的遺傳咨詢 本研究中夫婦一方染色體異常組胎兒染色體異常檢出率最高，該組共有5例，1例丈夫核型為47,XYY，胎兒核型為46,XY，正常分娩；1例丈夫核型為46,XY,t(1;3)(p36;q21)，胎兒核型為46,XX，理論上說平衡易位的父親有核型完全正常胎兒的幾率僅為1/18[7]，故及其幸運，該胎兒正常分娩。其余3例均為父母一方為平衡易位或倒位攜帶者，胎兒的核型與雙親之一相同，即遺傳性平衡易(倒)位。通過羊水穿刺檢查確診的胎兒染色體平衡易位或倒位可以來自遺傳或重新組合，故應(yīng)需對父母雙方的染色體核型進行檢查。如果胎兒繼承父母一方的平衡性結(jié)構(gòu)重組，那么子代的表現(xiàn)型是正常的。但是如果父母雙方染色體核型正常，胚胎染色體重組發(fā)生在早期的特殊時期，那么對子代造成的影響可能是明顯的畸形和智力障礙，風(fēng)險為8%～10%[8]。本文唐氏高危組1例，父母核型均正常，胎兒核型為46,XX,t(2;15)(q13;q15)，該胎兒的易位為新發(fā)生的，其智力低下或表型異常的風(fēng)險約為10%。鑒于系統(tǒng)超聲無結(jié)構(gòu)方面的明顯異常，該孕婦堅持繼續(xù)妊娠。

本研究1例21-三體兒生育史孕婦，于孕19周產(chǎn)前診斷，胎兒核型為46,Xdel(Y)(q11)，丈夫核型為46,XY,Y≈18。經(jīng)C帶證實，胎兒異染色質(zhì)部分完全丟失，生精基因位于Yq11～12區(qū)域及著絲粒附近區(qū)域，功能基因是否缺失尚不能確定，所以即使胎兒智力表型正常，其成年后是否有精子生成障礙尚不能確定。鑒于上述情況的遺傳咨詢，應(yīng)使孕婦及家屬充分知情后決定是否繼續(xù)妊娠。

綜上所述，羊膜腔穿刺術(shù)損傷小、安全、易于操作，羊水細胞培養(yǎng)染色體核型分析是產(chǎn)前診斷的常用方法。目前產(chǎn)前篩查、超聲診斷和羊水穿刺三者有效地結(jié)合是預(yù)防出生缺陷的最佳手段。

1 方群，游澤山，王彩玲，等.妊娠中晚期300例胎兒臍血染色體核型分析.中華醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)，2000,17：16-19.

2 侯紅英，李小毛，滕奔騎，等.妊娠中晚期羊水細胞核型分析.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2006,14：42-44.

3 陸國輝主編.產(chǎn)前遺傳病診斷.第1版.廣州：廣東科技出版社，2002.163.

4 高雪峰，邵敏杰，楊麗萍，等.羊水細胞培養(yǎng)染色體核型分析在產(chǎn)前診斷中的意義.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2009,17：45-46.

5 Drummond CL,Gomes DM,Senat MV，et al.Fetal karyotyping after 28 weeks of gestation for late ultrasound findings in a low risk population.Prenat Diagn,2003,23:1068.

6 Verdin SM,Whitlow BJ,Lazanakis M，et al.Ultrasonographic markers for chromosomal abnormalities in women with negative nuchal translucency and second trimester maternal serum biochemisty.Ultras Obst Gynec,2000,16:402.

7 左伋主編.醫(yī)學(xué)遺傳學(xué).第5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008.179.

8 Warburton D.Outcome of cases of de now structural rearrangements diagnosed at amniocentesis.Prenat Diagn，1984，4:69-80.

Significanceofamnioticfluidcellscultureintheprenataldiagnosisforchromosomaldiseases

LIUCi*,LIUYihui,LIUXuejun*,etal.*TheSecondHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050000,China

ObjectiveTo investigate the feasibility and necessity of amniotic fluid cells culture in the prenatal diagnosis for chromosomal diseases in order to prevent the birth of fetus with chromosomal diseases.MethodsThe 293 specimens of amniotic cell obtained by amniocentesis from 293 pregnant women with prenatal diagnosis indications were cultured and analyzed.ResultsAmong the 293 specimens of amniotic cell,14 cases of chromosome abnormality were found,with the chromosome abnormality rate being 4.78%,including 9 cases of chromosome number abnormality and 5 cases of chromosomal structure abnormality.The chromosome abnormality rates were different in different groups with different prenatal diagnosis indications,in which the chromosome abnormality rates were the highest in the group with one party of the couple with chromosome abnormality.ConclusionThe amniotic cell culture and chromosome karyotype analysis are the effective means in prenatal diagnosis for chromosomal diseases in the pregnant women with prenatal diagnosis indications at mid trimester of pregnancy,moreover,the combined detection of serological screening,chromosome examination and ultrasonic inspection plays an important role in the prevention of child birth defects.

chromosome;karyotype,fetus;amniocentesis;prenatal diagnosis

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.08.003

050000 石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院產(chǎn)科(劉慈、劉學(xué)軍、辛虹)，婦科(王振海)；河北省辛集市第一醫(yī)院骨科(劉義輝)；河北省遵化市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科(張曉艷)

辛虹，050000 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院；

E-mail:xh.hbyd@hotmail.com

R 596.1

A

1002-7386(2014)08-1132-03

2014-01-22)