★ 李偉鎮(zhèn) 張旭紅 黃清松

(1.廣東省第一榮軍醫(yī)院藥劑科 廣東 廣州 510260；2.廣東藥學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 廣東 廣州 510006)

肝纖維化是指各種原因引起的動(dòng)態(tài)創(chuàng)傷-愈合過程，以肝膠原及其他基質(zhì)蛋白增高為特征,引起肝臟結(jié)構(gòu)改變,導(dǎo)致肝功能下降，是因慢性反復(fù)損傷誘發(fā)的一種肝臟持續(xù)修復(fù)反應(yīng)。期間出現(xiàn)肝細(xì)胞的變性、壞死，炎癥細(xì)胞浸潤，細(xì)胞因子作用以及肝組織中細(xì)胞外基質(zhì)過度產(chǎn)生和沉積等。“正虛血瘀”作為肝纖維化的病理因素,為各家的主要共識(shí)[1-3]。紅花為常用的活血化瘀傳統(tǒng)中藥，具活血通經(jīng)、散瘀止痛功效。紅藥總黃素是紅花中所含的一組水溶性生物堿，具有廣泛的生物活性。相關(guān)研究顯示紅藥總黃素具有促進(jìn)機(jī)體免疫功能、抗氧化[4]、改善貧血(血虛)、抗血栓、刺激骨髓造血機(jī)能[5]、提高心肌細(xì)胞內(nèi)cAMP含量、降低心肌氧耗等作用[6]。本研究通過建立大鼠CCl4肝纖維化模型，觀察紅花總黃素對(duì)肝纖維化大鼠肝功能和相關(guān)血清指標(biāo)的影響，為紅花總黃素治療肝纖維化的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 以Wistar雄性大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物, 由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(粵)2008-0002。

1.1.2 藥品制備 紅花購自廣東寶芝林中藥有限公司，以料液比1∶10(g/mL)室溫浸提，提取劑為蒸餾水，時(shí)間30min，共浸提2次，合并浸提液，離心，去除藥渣。加入5倍無水乙醇，于4℃環(huán)境下靜置12h，過濾，水溶沉淀后濾過，過大孔樹脂柱得紅花總黃素水溶液，調(diào)整濃度至1.0g生藥/mL。

1.1.3 試劑 分析純CCl4由蘇州百與化工有限公司提供；血清GPT、GOT、Bil、TP、ALB試劑盒購自上海申索佑福醫(yī)學(xué)診斷用品有限公司；血清HA、LN、PCⅢ、IV-C試劑盒由上海海研所提供。

1.1.4 主要儀器 半自動(dòng)生化分析儀(康泰醫(yī)學(xué)系統(tǒng)有限公司，型號(hào)：BC300)。

1.2 方法

1.2.1 給藥 取Wistar雄性大鼠分為4組，每組10只：對(duì)照組，模型組，紅花總黃素低、高劑量組。除正常組外，其它各組大鼠首次皮下注射純CCl45mL/kg，以后皮下注射含20% CCl4的花生油3mL/kg，2次/周，連續(xù)12周[7]。第7周起，低、高劑量紅花總黃素組灌胃相應(yīng)劑量紅花總黃素水溶液，1次/天。

1.2.2 檢測(cè)血清指標(biāo) 末次給藥并禁食16h，觀察各組大鼠癥狀并稱體重,然后以3%戊巴比妥麻醉大鼠，經(jīng)頸總動(dòng)脈取血，分離血清，-20℃保存?zhèn)溆?。?yán)格按試劑盒說明書中操作方法檢測(cè)各組大鼠血清肝功能指標(biāo)GPT、GOT、Bil、TP、ALB及肝纖維化4項(xiàng)指標(biāo)HA、LN、PCIII、IV-C。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般狀態(tài) 正常組大鼠體重明顯增加,毛發(fā)光澤順滑，動(dòng)作靈敏。模型組大鼠體態(tài)消瘦，體重減輕，毛色蓬松干枯，現(xiàn)萎靡、嗜臥、活動(dòng)減少。紅花總黃素低、高劑量組大鼠上述表現(xiàn)較模型組有良性逆轉(zhuǎn)。

2.2 對(duì)大鼠血清肝功能指標(biāo)的影響 與正常組比較，模型組大鼠血清GPT、GOT、Bil水平明顯升高(P<0.01)，TP、ALB水平明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，低、高劑量紅花總黃素組血清GPT、GOT、Bil水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，高劑量紅花總黃素組血清TP、ALB水平明顯升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠血清肝功能指標(biāo)水平±s，n=10)

2.3 對(duì)大鼠血清肝纖維化指標(biāo)的影響 模型組較正常組大鼠血清HA、LN、IV-C、PCⅢ水平顯著升高(P<0.01)。低、高劑量紅花總黃素組較模型組大鼠血清HA、LN、IV-C、PCⅢ水平均明顯降低(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2 各組大鼠血清肝纖維化指標(biāo)水平±s，n=10)

3 討論

CCL4誘導(dǎo)大鼠肝損傷模型是研究肝損害和肝纖維化的經(jīng)典方法。其機(jī)制為CCL4經(jīng)肝細(xì)胞微粒體內(nèi)細(xì)胞色素P450代謝裂解成的三氯甲基自由基而致脂質(zhì)過氧化,并介導(dǎo)肝細(xì)胞損傷,如肝細(xì)胞脂肪變及壞死，從而激活貯脂細(xì)胞,導(dǎo)致膠原分泌增加,形成肝纖維化[8]。同時(shí)，脂質(zhì)過氧化使肝細(xì)胞膜受損,導(dǎo)致肝細(xì)胞內(nèi)ALT、AST等酶外漏,血清ALT和AST活性增高[9]。血清總蛋白(TP)、白蛋白(ALB)為反映肝細(xì)胞合成代謝功能的指標(biāo)，肝功能受損時(shí),二者在血液中濃度隨之降低，其降低程度與肝功能損害程度呈正相關(guān)。肝損傷后，因膽紅素代謝和排泄障礙導(dǎo)致血清Bil水平增高。因此,血清ALT、AST、Bil、TP、ALB水平為反映肝功能受損程度的指標(biāo)。HA主要由肝內(nèi)皮細(xì)胞攝取分解,肝細(xì)胞損害時(shí),肝內(nèi)皮細(xì)胞降解HA減少,血清HA水平升高；LN由肝星狀細(xì)胞合成,在肝硬化/肝纖維化時(shí)，LN合成量顯著增加；PCⅢ和CⅣ是組成基底膜網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的主要成分,參與構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì),正常人肝細(xì)胞PCⅢ和CⅣ含量極微,肝纖維化早期，PCⅢ和CⅣ含量明顯增加,與持續(xù)沉積的LN最終形成完整的基底膜,導(dǎo)致肝臟纖維化和硬化。因此，血清HA、LN、PCIII、IV-C水平為反映肝纖維化程度的重要指標(biāo)[10]，統(tǒng)稱為“肝纖四項(xiàng)”，即肝纖維化四項(xiàng)檢查。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠血清GPT、GOT、Bil、HA、LN、IV-C、PCⅢ水平明顯升高(P<0.01)，TP、ALB水平明顯降低(P<0.05)，提示肝纖維化大鼠模型制備成功；給予紅花總黃素治療后，大鼠血清Bil、GPT、GOT、HA、LN、IV-C、PCⅢ水平明顯降低(P<0.05或P<0.01)，TP、ALB水平明顯升高(P<0.05)，提示紅花總黃素能有效地改善CCL4所致大鼠肝損傷,增強(qiáng)肝臟功能,延緩肝纖維化的形成。其具體機(jī)制有待進(jìn)一步的研究。

[1]洪朝金.肝纖維化病機(jī)治法研究概況[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2007,25(2):330-331.

[2]李燚光，代海峰，薛博瑜，等.清化瘀毒法對(duì)大鼠肝纖維化進(jìn)程的干預(yù)作用[J].時(shí)珍國醫(yī)國藥，2010，21(11)：2 952-2 954.

[3]李小紅，葉軍.中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合治療肝硬化研究進(jìn)展[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志，2011，25(12)：49-51.

[4]Tian J，Li G，Liu Z，et al．Hydroxysafflor yellow A inhibits rat brain mitochondrial permeability transition pores by a free radical scavenging action[J].Pharmacology，2008，82(2)：121-126.

[5]康永，杜曉峰，許強(qiáng).紅花黃素藥理研究[J].中成藥，1997，19(12)：38.

[6]聶克.紅花對(duì)心血管系統(tǒng)作用的研究概況[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，1996，16(6)：379.

[7]張曉麗.桂枝茯苓丸防治肝纖維化的實(shí)驗(yàn)研究[J].湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2005，7(1)：16-18.

[8]趙玉瑤，劉方洲，楊小平，等.臌脹片抗大鼠肝纖維化作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2003年，23(12)：922-925.

[9]童英,閆向東,高珊,等.四氯化碳急性肝損傷敏感指標(biāo)的研究[?].中國食品衛(wèi)生雜志,2000,12(6):10-13.

[10]董永杰，彭彥輝， 趙曉云，等.肝纖維化血清學(xué)診斷方法的研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2007，13(22)：1743.