項峰 任利萍 劉克勤 王曉云 張凡 陳江平 舒麗莎

·藥物研究·

子宮頸癌腫瘤干細胞篩選及體外敏感藥物試驗的臨床對比研究

項峰 任利萍 劉克勤 王曉云 張凡 陳江平 舒麗莎

MTT法；子宮頸癌；藥物篩選試驗；流式細胞術(shù)；腫瘤干細胞

子宮頸癌的輔助化療出現(xiàn)耐受導(dǎo)致化療失敗的病例常見，目前研究發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞的存在可能導(dǎo)致腫瘤耐藥，CD133是多種腫瘤干細胞的標記物，在子宮頸癌的浸潤前沿分布密集，本實驗利用流式細胞術(shù)磁珠方法篩選腫瘤干細胞；同時利用體外藥物敏感性試驗對臨床常用的藥物譜進行抗腫瘤藥物敏感性試驗，利用MTT比色法測定體外腫瘤藥敏的平均抑制率。

1 材料與方法

1.1 儀器與藥物

1.1.1 儀器:酶標儀(美國BIO-550 ),5%CO2培養(yǎng)箱，微量移液器(芬蘭，上海雷勃分析儀器有限公司)，流式細胞儀(BD公司)。

1.1.2 抗腫瘤藥物:均從本院藥房領(lǐng)取，用生理鹽水(其中卡鉑、多柔比星、表柔比星需用注射用水)配制成實驗液，各種藥物的配制濃度分別為：多柔比星(ADM)0.4 mg/ml，表柔比星(e-ADM)0.8 mg/ml,順鉑(DDP) 1 mg/ml，卡鉑(CBP) 0.5 mg/ml,甲氨蝶呤(MTX) 0.1 mg/ml，長春新堿(VCR) 0.1 mg/ml,長春地辛(VDS) 40 mg/ml,長春瑞濱(NVB) 0.8 mg/ml，伊立替康(CPT-11) 0.8 mg/ml，拓撲替康(Topotecan) 0.1 mg/ml,依托泊苷(Vp-16) 1 mg/ml，替尼泊苷(VM-26)1 mg/ml,羥基喜樹堿(HCPT) 0.5 mg/ml，紫杉醇(Taxol) 0.5 mg/ml,吉西他濱(Gemzar) 3.33 mg/ml，博來霉素(BLM) 0.3 mg/ml，絲裂霉素(MMC)0.1 mg/ml，氟尿嘧啶(5-Fu)1 mg/ml。

1.2 方法

1.2.1 免疫磁珠法分選子宮頸癌組織中的腫瘤干細胞:利用眼科剪剪取新鮮子宮頸癌腫瘤組織，剪碎后120目銅網(wǎng)規(guī)過濾，去紅細胞后制成腫瘤實質(zhì)組織的原代單細胞懸液，計數(shù)并重懸于1 ml 1% FBS-RPMI中，將50 μl已包被CD133一抗的磁珠與預(yù)冷細胞懸液1 ml混合，4℃孵育后將細胞懸液置于磁性顆粒分離器中3 min以上，依次收集含有CD133陽性細胞和CD133陰性細胞的分選液，將分選液離心，去上清液分別收集CD133+和CD133-細胞，PBS離心并洗滌后，用2×105活細胞/ml的濃度接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)擴增并傳代，依此獲取足量的CD133陽性細胞。

1.2.2 用MTT法對腫瘤細胞標本進行測定:分別收集CD133+和CD133-對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度，每孔加入100 μl,鋪板使待測細胞調(diào)密度1 000～10 000孔，5%CO2，37℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底(96孔平底板),加入不同種類的藥物,每孔100 μl,5%CO2，37℃孵育16～48 h，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20 μlMTT溶液(5 mg/ml，即0.5%MTT)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。 終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。 每孔加入在酶聯(lián)免疫檢測儀150 μl二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。D490 nm處測量各孔的吸光值。

2 結(jié)果

2.1 體外藥物敏感試驗顯示多種單藥的平均抑制率均大于20%，而臨床的有效率多數(shù)小于20%，兩者的差異在多數(shù)藥物都比較明顯(P<0.05)。見表1。

2.2 不同藥物對腫瘤干細胞與腫瘤細胞平均抑制率的對比 多種藥物對腫瘤干細胞的敏感性明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；少數(shù)藥物兩者抑制率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

3 討論

腫瘤干細胞(tumor stem cell，TSC)是一群由正常干細胞經(jīng)演變發(fā)生基因異常表達的腫瘤細胞，目前的研究顯示腫瘤干細胞的存在與多種腫瘤的多藥耐藥以及放療耐受相關(guān)。由于腫瘤干細胞具有極強的自身更新能力和經(jīng)常處于靜止期的特性，以及細胞膜高表達多種耐藥基因蛋白，便利其逃脫細胞毒藥物的殺傷作用，從而使腫瘤在化療后極易出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移。腫瘤干細胞經(jīng)過基因突變的積累，獲得多藥耐藥機制并遺傳下來；或存在基因突變和分化異常導(dǎo)致復(fù)發(fā)的腫瘤出現(xiàn)了多藥耐藥性；而且目前的化療藥物多數(shù)是細胞周期抑制劑，它們對經(jīng)常處于靜止期腫瘤干的消除無效[1]。因此本實驗利用流失細胞術(shù)分選子宮頸癌的原代腫瘤干細胞，培養(yǎng)后進行常見臨床化療藥物的敏感性篩選，希望為子宮頸癌的個性化治療提供科學(xué)依據(jù)。

表1 體外藥物敏感試驗結(jié)果與臨床有效率比較

注：與臨床有效率比較，*P<0.05

表2 腫瘤干細胞與腫瘤細胞平均抑制率的對比分析 n=59，%

新輔助化療是子宮頸癌的有效的輔助治療方式，其主要通過縮小腫瘤原發(fā)灶和消除亞臨床轉(zhuǎn)移灶達到控制腫瘤發(fā)展，降低臨床分期，爭取手術(shù)機會，減少手術(shù)風(fēng)險的目的，但是腫瘤耐藥性的存在導(dǎo)致化療失敗，預(yù)后不佳。已有的研究顯示在多種腫瘤(包括口腔鱗癌、食管癌、乳腺癌等)存在腫瘤干細胞，并且分布較為集中的浸潤前沿細胞免疫表型具有其特殊性，此區(qū)域腫瘤細胞梭形變明顯，粘附性差，分化較低，對放化療抗拒，是局部復(fù)發(fā)和治療失敗的關(guān)鍵因素[2,3]。而CD133是目前公認的腫瘤干細胞的特異性標志物，可據(jù)此利用流式細胞儀將腫瘤干細胞從腫瘤組織中分離開來。在子宮頸癌腫瘤細胞培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細胞具有很強的自我更新和增殖能力，而CD133陰性細胞不分裂，不增殖。國內(nèi)的移植瘤研究發(fā)現(xiàn)：CD133陽性細胞體內(nèi)致瘤試驗具有較強的致瘤能力，而CD133陰性細胞無致瘤能力。另有研究發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)母細胞瘤來源的CD133陽性細胞可以長期保持未分化狀態(tài)。因此本實驗利用流式細胞儀將子宮頸癌的腫瘤干細胞分離并培養(yǎng)研究其與腫瘤細胞在耐藥性方面的差異，為篩選敏感藥物和制定個性化的化療方案提供依據(jù)。本實驗在體外敏感藥物篩選中發(fā)現(xiàn)腫瘤干細胞標記CD133陽性細胞的耐藥性比例明顯高于腫瘤細胞，同時腫瘤干細胞在形態(tài)方面與腫瘤細胞相比亦存在明顯的差別，提示腫瘤干細胞通過細胞表型變化獲得耐藥性，同時通過細胞形態(tài)改變更具侵襲性。

腫瘤化療的個性化治療是未來治療的方向，而測試腫瘤藥物敏感性的試驗MTT比色法，方法簡單、快速、高效、靈敏，重復(fù)性較高，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于體外腫瘤藥敏的測定。此種體外篩選實驗對指導(dǎo)臨床治療和藥物的篩選具有明顯的指導(dǎo)意義。根據(jù)體外藥敏篩選試驗結(jié)果可指導(dǎo)臨床用藥，可以提高化療療效，提示盡可能減少交叉耐藥[4-6]。本實驗研究顯示體外敏感藥物和臨床的療效差異較大，而體外藥敏試驗陰性藥物臨床出現(xiàn)耐藥幾率較少，陰性準確率較高，因而試驗結(jié)果對于化療前排除不敏感的抗腫瘤藥物非常有價值。同時體外篩選陽性藥物與臨床用藥的差異較大，推測其出現(xiàn)的主要原因在于體外腫瘤細胞生存與體內(nèi)腫瘤細胞生長的環(huán)境差別很大，體內(nèi)腫瘤細胞與細胞外微環(huán)境的相互作用，共同導(dǎo)致耐藥的發(fā)生，但是體外敏感篩選試驗去除了機體免疫以及細胞外微環(huán)境對藥物的敏感性影響因素。

1 Rasper M,Schfer A,Pionte KG.Aldehyde dehydrogenase 1 positive glioblastoma cells show brain tumor stem cell capacity.Neuro Oncol，2010，12:1024-1033.

2 Yunqing Li,Angela Li,Martin Glas.c-Met signaling induces a reprogramming network and supports the glioblastoma stem-like phenotype Proc Natl Acad Sci USA，2011，108:9951-9956.

3 Manran L,Toshiyuki S,Mathew C.Casimiro.The canonical NF-κB pathway governs mammary tumorigenesis in transgenic mice and tumor stem cell expansion.Cancer Res，2010，70:10464-10473.

4 Lin C,Shideng B,Jeremy N.Rich.Potential Therapeutic Implications of Cancer Stem Cells in Glioblastoma.Biochem Pharmacol，2010，80:654-665.

5 Peisu Z,Justin D,William A,et al.Squelching Glioblastoma Stem Cells by Targeting REST for Proteasomal Degradation.Trends Neurosci，2009，32:559-565.

6 Christine L，C Ines B,Christina S.Normal and neoplastic nonstem cells can spontaneously convert to a stem-like state.Proc Natl Acad Sci USA，2011，108:7950-7955.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.02.058

075000 河北省張家口市，河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院

R 711.74

A

1002-7386(2014)02-0285-03

2013-10-18)