稅春，施永海，華雪銘，張忠華，張海明，劉永士

(1.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2.上海市水產(chǎn)研究所，上海200433；3.上海高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái)上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心，上海 201306；4.上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

鹽度漸變對(duì)斑尾復(fù)鰕虎魚幼魚血清滲透壓和離子濃度及鰓絲Na+/K+–ATP酶活力的影響

稅春1,2,3,4，施永海2*，華雪銘1,3,4，張忠華2，張海明2，劉永士2

(1.上海海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)部淡水水產(chǎn)種質(zhì)資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 201306；2.上海市水產(chǎn)研究所，上海200433；3.上海高校知識(shí)服務(wù)平臺(tái)上海海洋大學(xué)水產(chǎn)動(dòng)物遺傳育種中心，上海 201306；4.上海市水產(chǎn)養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

為了解斑尾復(fù)鰕虎魚的滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制，設(shè)置0.5、10、15、20、25、30、35、40、50共10個(gè)鹽度組，采用外界鹽度漸變的方法對(duì)該魚幼魚血清滲透壓、血清離子濃度及鰓絲Na+/K+–ATP酶活力進(jìn)行了檢測(cè)和分析。結(jié)果顯示：在鹽度0～50內(nèi)，血清滲透壓及血清離子含量均隨鹽度升高而升高，鹽度為40～50時(shí)，血清滲透壓及各離子含量均顯著高于對(duì)照組(鹽度6)；在0～35的鹽度中，血清滲透壓及離子含量都保持相對(duì)穩(wěn)定，在0鹽度組，鰓絲Na+/K+–ATP酶活性最強(qiáng)，25和35鹽度組的鰓絲Na+/K+–ATP酶活性比5～20和40～50鹽度組的明顯增強(qiáng)，25和35鹽度組之間Na+/K+–ATP酶活性無顯著性差異，5～20和40～50鹽度組之間也均無顯著差異，在鹽度5～35內(nèi)，鰓絲Na+/K+–ATP酶活性隨外界鹽度升高呈升高趨勢(shì)；回歸分析得到血清等滲點(diǎn)為0.308 mol/kg，相對(duì)應(yīng)的鹽度為10.8；Na+、Cl–、K+等離子點(diǎn)分別為340.28、137.08和4.51 mmol/L，相對(duì)應(yīng)的鹽度分別為28.1、8.9和 18.5。以上結(jié)果表明，斑尾復(fù)鰕虎魚幼魚對(duì)外界鹽度變化有較強(qiáng)的適應(yīng)性，屬于廣鹽性魚類，其鹽度的耐受范圍和適宜范圍分別為0.3～35和5～15。

斑尾復(fù)鰕虎魚；鹽度；血清滲透壓；血清離子；鰓絲Na+/K+–ATP酶活性

鰓作為魚類主要的滲透壓調(diào)節(jié)器官，在其適應(yīng)外界環(huán)境鹽度變化的過程中發(fā)揮著積極作用，能調(diào)節(jié)單價(jià)離子的吸收或排出[1–3]。鰓的泌氯細(xì)胞表面具有高活力的 Na+/K+–ATP酶[4]，對(duì)于維持細(xì)胞膜對(duì)離子的通透性、各離子濃度與滲透壓的穩(wěn)定具有重要作用。國(guó)內(nèi)外對(duì)魚類滲透壓調(diào)節(jié)的研究多以鰓絲Na+/K+–ATP酶、血清滲透壓和離子濃度等作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。

斑尾復(fù)鰕虎魚(Synechogobius ommaturus Richardson)，俗稱光魚，屬鰕虎魚科(Gobiidae)，復(fù)鰕虎魚屬(Synechogobius)，是鰕虎魚中的大型經(jīng)濟(jì)魚類，主要棲息于近岸底層的淤泥或沙質(zhì)水域，具有較強(qiáng)的鹽度耐受能力，不僅可以在海水中生長(zhǎng)，還能在河口處存活[5–6]。該魚生長(zhǎng)迅速，肉質(zhì)細(xì)嫩，味道鮮美，越來越受到消費(fèi)者的喜愛。近年來，該魚?；祓B(yǎng)于菊黃東方鲀池塘中，并有較好的養(yǎng)殖效益。目前，有關(guān)斑尾復(fù)鰕虎魚的研究主要集中在遺傳、分類、繁殖等方面[7–9]。關(guān)于該魚的滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制和調(diào)節(jié)能力的研究很少有報(bào)道。本研究檢測(cè)和分析鹽度漸變過程中斑尾復(fù)鰕虎魚血清滲透壓、血清離子含量及鰓絲Na+/K+–ATP酶活力，旨在掌握斑尾復(fù)鰕虎魚對(duì)外界鹽度變化的生理響應(yīng)，探討該魚的滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制，為更好地保護(hù)和開發(fā)斑尾復(fù)鰕虎魚資源提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試魚

試驗(yàn)用斑尾復(fù)鰕虎魚幼魚捕撈自菊黃東方鲀混養(yǎng)池塘，暫養(yǎng)于室內(nèi)水泥池，每天以商品膨化料(粗蛋白45%，粗脂肪6.5%)表觀飽食投喂2次(8:00、16:00)。2周后，挑選270尾體格健康、個(gè)體均勻的幼魚，體質(zhì)量(17.43±3.11) g，體長(zhǎng)(111.56±6.68) mm，隨機(jī)分配到9個(gè)容積為200 L的水缸中，每缸30尾，水的鹽度為6。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置0、5、10、15、20、25、30、35、40 和50共10個(gè)鹽度組及對(duì)照組(當(dāng)?shù)刈匀缓ＫM，鹽度為6)。將幼魚于鹽度為6的水中穩(wěn)定3 d。隨機(jī)從3個(gè)缸中分別取5尾鰕虎魚作為對(duì)照組樣品。對(duì)照樣品采集后，隨機(jī)選取其中3個(gè)缸的幼魚作為降鹽組試驗(yàn)魚，剩余6個(gè)缸的幼魚作為升鹽組試驗(yàn)魚通過添加濃縮海水或除氯自來水的方法以每天2～3鹽度的速度升降至目標(biāo)鹽度，用YSI30鹽度計(jì)測(cè)量鹽度。每到目標(biāo)鹽度后從相應(yīng)的缸中分別取5尾魚置于相同鹽度(即該采樣鹽度)、相同水體的缸中穩(wěn)定 3 d，其余繼續(xù)進(jìn)行鹽度的升降和采樣。整個(gè)試驗(yàn)持續(xù)21 d。每次取樣前24 h停止投喂。

1.3 試驗(yàn)管理

暫養(yǎng)和試驗(yàn)期間(鹽度為6)，每天定時(shí)吸污、換水，換水量約 2/3。整個(gè)試驗(yàn)過程持續(xù)充氧，采用自然光照和自然光周期(14 h光照)。水溫25.0～29.2℃，pH 7.71～8.25，溶氧量＞6.0 mg/L。

1.4 樣品采集

血清的采集：采樣前將魚置于冰水中麻醉[10]，撈出并擦干體表水分，用1 mL一次性無菌注射器從尾部靜脈取血，然后轉(zhuǎn)移至已預(yù)冷的1.5 mL無菌離心管中。于0 ℃冰箱中放置過夜后，用冷凍離心機(jī)8 000 r/min、4 ℃離心20 min，將上層血清收集保存于–80 ℃冰箱中，解凍后測(cè)定滲透壓和離子含量。

鰓絲的采集：將采完血的魚立即放入冰盤中，先取下整個(gè)鰓，用預(yù)冷的生理鹽水(1.2%)清洗，用濾紙吸干水分，采集鰓絲置于預(yù)冷的離心管中，保存于–80 ℃冰箱中，解凍后測(cè)定Na+/K+–ATP酶活力。

每次采樣前分別采集相應(yīng)外界水環(huán)境的水樣于0～4 ℃保存，用以檢測(cè)滲透壓和離子濃度。

1.5 樣品的測(cè)定

酶液的制備：稱取0.1 g鰓絲，加入0.9 mL生理鹽水，用高速勻漿器在冰浴中以2 000 r/min勻漿1 min，勻漿液用高速冷凍離心機(jī)3 000 r/min離心10 min，取上清液作為待測(cè)樣本，于 24 h內(nèi)完成Na+/K+–ATP酶活力測(cè)定。

Na+/K+–ATP酶活性采用南京建成生物工程研究所的超微量Na+/K+–ATPase測(cè)定試劑盒測(cè)定。組織蛋白含量采用BCA法[11]測(cè)定。以每小時(shí)每毫克組織蛋白中的ATP酶分解ATP產(chǎn)生1 μmol無機(jī)磷的量為一個(gè)ATP酶活力單位(U)。

血清和外界水體滲透壓用冰點(diǎn)滲透壓儀(Gonotec 030，德國(guó))測(cè)定。血清和水體Na+、K+、Cl–的含量采用南京建成生物公司的檢測(cè)試驗(yàn)盒測(cè)定。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用 Excel 2003對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理，用SPSS17.0分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和單因素方差分析。若影響顯著，則進(jìn)行Duncan’s多重比較

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽度漸變對(duì)供試魚血清滲透壓與離子濃度的影響

鹽度為10～30時(shí)，血清滲透壓隨鹽度升高而升高(表1)。在鹽度為50的環(huán)境中，血清滲透壓最高(P ＜0.05)，其次是鹽度為40的試驗(yàn)組。從鹽度由0升高至35時(shí)，除鹽度0與30組間存在差異(P＜0.05)外，其余各組血清滲透壓之間無顯著差異(P＞0.05)血清滲透壓與水體滲透壓間的關(guān)系可以用線性方程表示，回歸直線和等滲線的交點(diǎn)顯示血清的等滲點(diǎn)為0.308 mol/kg，相對(duì)應(yīng)的鹽度為10.8(圖1)。

表1 不同試驗(yàn)鹽度下水體和血清滲透壓與離子含量Table 1 Plasma osmolality and ions concentration in goby young fish and its surrouding water from groups with different salinity

圖1 斑尾復(fù)鰕虎魚血清滲透壓和外界水體滲透壓的關(guān)系Fig. 1 The relationship between the plasma and medium osmolality in goby young fish (Synechogobius ommaturus Richardson)

對(duì)照組血清Na+含量最低，但與0和5鹽度組無顯著差異(P＞0.05)(表1)。鹽度為10～50環(huán)境下的血清Na+含量較對(duì)照組均有上升，且鹽度為40的試驗(yàn)組含量最高(P＜0.05)。鹽度為0～35，Cl–含量保持相對(duì)穩(wěn)定。至鹽度40及50，其含量顯著升高(P＜0.05)。在鹽度40與50條件下，血清K+含量較高。0～35(除20鹽度組外)鹽度組間的血清K+含量無顯著差異(P＞0.05)。血清 Na+、Cl–和 K+與水體相應(yīng)指標(biāo)均可以用線性方程來良好的擬合(表2)。根據(jù)方程得到 Na+、Cl–和 K+的等離子點(diǎn)分別是340.28、137.08和4.51 mmol/L，相對(duì)應(yīng)的鹽度分別是28.1、8.9和18.5。

表2 斑尾復(fù)鰕虎魚幼魚血清離子濃度與水體相應(yīng)指標(biāo)的相關(guān)性Table 2 The relationship between the plasma and medium ions concentration in goby young fish (Synechogobius ommaturus Richardson)

2.2 鹽度漸變對(duì)斑尾復(fù)鰕虎魚鰓絲 Na+/K+–ATP酶活性的影響

從圖 2可以看出，0鹽度組幼魚的鰓絲Na+/K+–ATP酶活性最強(qiáng)(P＜0.05)；25和35鹽度組幼魚的鰓絲 Na+/K+–ATP酶活性明顯比 5～20和40～50鹽度組的強(qiáng)(P＜0.05)，但在25和35鹽度組之間無顯著性差異(P＞0.05)，5～20和40～50鹽度組之間也均無顯著性差異(P＞0.05)。另外，在鹽度5～35，幼魚鰓絲Na+/K+–ATPase酶活性與外界鹽度呈正相關(guān)關(guān)系，可用線性方程y = 0.66x + 33.75(r2= 0.50；P＜0.01)來擬合。

圖2 斑尾復(fù)鰕虎魚幼魚鰓絲Na+/K+–ATP酶活性與鹽度的關(guān)系Fig. 2 Gill Na+/K+–ATPase activities in goby young fish (Synechogobius ommaturus Richardson.) reared at different salinities

3 討 論

a. 斑尾復(fù)鰕虎魚幼魚血清滲透壓及離子濃度的變化規(guī)律。斑尾復(fù)鰕虎魚幼魚的血清滲透壓在0.286～0.453 mol/kg，介于狹鹽性的海水和淡水魚的血清滲透壓之間[11–13]，說明斑尾復(fù)鰕虎魚是廣鹽性魚類。廣鹽性魚類進(jìn)入高滲環(huán)境后，由于魚體滲透壓低于外界滲透壓，魚體會(huì)被動(dòng)失水。為了補(bǔ)償水分，魚類開始大量吞飲海水，補(bǔ)充水分的同時(shí)也攝入了大量離子，血清離子濃度相對(duì)升高，滲透壓也因此升高；血清滲透壓的升高誘使Na+/K+–ATP酶活力提高，加強(qiáng)對(duì)過剩的鹽離子的外排作用，避免滲透壓過渡升高并維持其穩(wěn)定[13–14]。當(dāng)斑尾復(fù)鰕虎魚幼魚血清滲透壓升高時(shí)，血清中 Na+、Cl–濃度也在上升，且增幅較大，說明這2種離子對(duì)血清滲透壓的影響較大。但斑尾復(fù)鰕虎魚幼魚血清中K+濃度的增幅卻并不顯著，這與趙峰等[15–16]對(duì)史氏鱘(Acipenser schrenckii)的研究結(jié)果一致。即當(dāng)史氏鱘血清 Na+、Cl–濃度升高后，K+濃度并未出現(xiàn)較大波動(dòng)，證明細(xì)胞膜保持著較好的完整性。

b. 斑尾復(fù)鰕虎魚幼魚鰓絲Na+/K+–ATP酶活性的變化規(guī)律。魚類的鰓上皮細(xì)胞中具有可以調(diào)節(jié)細(xì)胞膜離子通透性的Na+/K+– ATP酶，它能維持血清離子及滲透壓穩(wěn)定[4,17]。生活在等滲環(huán)境中的廣鹽性魚類，其鰓絲Na+/K+–ATP酶活力較低[18]。隨著外界水體鹽度的上升，Na+/K+–ATP酶活力也會(huì)上升，本研究在5～35鹽度范圍內(nèi)Na+/K+–ATP酶活性呈現(xiàn)與之基本相同的變化規(guī)律，即在鹽度 5～20時(shí)，Na+/K+–ATP酶活力較低，隨著鹽度的逐漸升高，鰓絲Na+/K+–ATP酶活力隨之上升。較大的內(nèi)外滲透壓差或離子濃度差是迫使機(jī)體提高鰓絲Na+/K+–ATP酶活力，以排除過多鹽離子的主要原因[12]。但是，當(dāng)鹽度上升至40～50時(shí)，鰓絲Na+/K+–ATP酶活力不但沒有繼續(xù)升高，反而降低，這種現(xiàn)象在遮目魚(Chanos ahanos)[19]和大鱗鲃(Barbus capito)[12]均有發(fā)現(xiàn)。這可能是高鹽度脅迫使鰓絲Na+/K+–ATP酶活力產(chǎn)生了不可逆的變化，因此，鹽度40和50已經(jīng)超過了該魚的耐受范圍。

c. 斑尾復(fù)鰕虎魚幼魚的滲透壓調(diào)節(jié)。從斑尾復(fù)鰕虎魚幼魚鰓絲 Na+/K+–ATP酶活力的變化情況看，位于等滲點(diǎn)附近的酶活較低，隨著鹽度的升高或下降，酶活均上升，屬典型的廣鹽性魚類。雖然血清K+、Na+、Cl–含量隨鹽度升高而呈上升趨勢(shì)，但回歸方程的斜率均較低，血清滲透壓維持在0.288～0.374 mol/kg，說明斑尾復(fù)鰕虎魚具有較強(qiáng)的離子調(diào)節(jié)能力，這對(duì)于維持機(jī)體滲透壓穩(wěn)定和對(duì)水體鹽度變化的適應(yīng)具有積極意義。

綜上所述，斑尾復(fù)鰕虎魚幼魚對(duì)鹽度變化具有較強(qiáng)的適應(yīng)性，其適宜的鹽度范圍為 5～15，可耐受的鹽度范圍為0.3～35。

[1] Evans D H，Claiborne J B．The Physiology of Fishes [M]．Boca Raton：CRC Press，1993：315–343．

[2] 魏渲輝，汝少國(guó)，徐路，等．海水和淡水適應(yīng)過程中廣鹽性魚類鰓氯細(xì)胞的形態(tài)與功能變化及其激素調(diào)節(jié)[J]．海洋科學(xué)，2001，25(4)：16–20．

[3] Foskett J K，Scheffey C．The chloride cells：Definitive identification as the salt-secretory cell in teleosts[J]. Science，1982，215(4529)：164–166．

[4] Karnaky K J．Structure and function of the chloride cell of Fundulus heterolitus and other teleosts[J]．American Society of Zoologists，26(1)：209–224．

[5] 成慶泰，鄭葆珊．中國(guó)魚類系統(tǒng)檢索[M]．北京：科學(xué)出版社，1987：429–436．

[6] 陳大剛．魚港內(nèi)斑尾復(fù)鰕虎魚生物學(xué)的初步調(diào)查[J]．動(dòng)物學(xué)雜志，1978(1)：12–15．

[7] 宋娜，宋林，高天翔，等．斑尾復(fù)鰕虎魚群體多樣性比較分析[J]．水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2011，35(2)：321–326．

[8] Na S，Xiu M Z，Tian X G．Genetic diversity and population structure of spottedtail goby (Synechogobius ommaturus) based on AFLP analysis [J]．Biochemical Systematics and Ecology，2010，38(6)：1089–1095．

[9] 孫幗英，陳建過．斑尾復(fù)鰕虎魚的生物學(xué)研究[J]．水產(chǎn)學(xué)報(bào)，1993，17(2)：146–153．

[10] 王瑞芳，莊平，馮廣鵬，等．鹽度升高對(duì)中華絨螯蟹幾種非特異性免疫因子的影響[J]．水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2012，36(4)：546–552．

[11] Smith，P K，Krohn R I，Hermanson G T，et al Measurement of protein using bicinchoninic acid[J]. Analytical Biochemistry，1985，150(1)：76–85.

[12] 耿龍武，徐偉，李池陶，等．鹽堿對(duì)大鱗鲃血清滲透壓、離子含量及鰓絲Na+/K+–ATP酶活力的影響[J]．中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2011，18(2)：458–465．

[13] 潘魯青，唐賢明，劉泓宇，等．鹽度對(duì)褐牙鲆(Paralichthys olivaceus)幼魚血漿滲透壓和鰓絲Na+/K+–ATPase 酶活力的影響[J]．海洋與湖沼，2006 37(1)：1–6．

[14] Xuguang H，Ping Z，Longzhen Z，et al．Osmoregulation in juvenile Chinese sturgeon (Acipenser sinensis Gray) during brackish water adaptation [J]．Fish Physiol Biochem，2009，35(2)：223–230．

[15] 趙峰，莊平，章龍珍，等．鹽度馴化對(duì)史氏鱘鰓Na+/K+–ATP酶活力、血清滲透壓及離子濃度的影響[J]．水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2006，30(4)：444–449．

[16] McEnroe M，Cech J J．Osmoregulation in juvenile and adult white sturgeon，Acipenser transmontanus[J]．Env Bio Fish，1985，14(1)：23–30．

[17] 林浩然．魚類生理學(xué)[M]．3版．廣州：廣東高等教育出版社，2002：119–132．

[18] Mancera J M，Mccormic S D．Rapid activation of gill Na+/K+–ATPase in the euryhaline teleost Fundulus heteroclitus [J]．J Exp Zool，2000，287(4)：263–274．

[19] Lin Y M，Chen C N，Lee T H．The expression of gill Na+，K+–ATPase in milkfish，Chanos chanos，acclimated to seawater，brackish water and fresh water [J]．Comp Biochem Physiol，2003，135(3)：489–497．

責(zé)任編輯：羅 維

英文編輯：羅 維

Effects of gradual salinity change on plasma osmolality, ions and gill Na+/K+-ATPase activity of goby (Synechogobius ommaturus Richardson) young fish

SHUI Chun1, 2,3,4，SHI Yong-hai2*，HUA Xue-ming1,3,4，ZHANG Zhong-hua2，ZHANG Hai-ming2，LIU Yong-shi2
(1.Key Laboratory of Freshwater Fishery Germplasm Resources, Ministry of Agriculture, Shanghai 201306, China; 2.Shanghai Fisheries Research Institute, Shanghai 200433, China; 3.Shanghai University Knowledge Service Platform, Shanghai Ocean University Aquatic Animal Breeding Center, Shanghai 201306, China; 4.Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture, Shanghai 201306, China)

Changes in plasma osmolality, concentration of ions (Na+, Cl–, K+) and gill Na+/K+–ATPase activity of goby (Synechogobius ommaturus Richardson) young fish were valued by gradually changing the medium salinity from 6 (control) to 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, and 50. The changes of both of the plasma osmolality and ions showed a similar trend, which increased with the increasing of medium salinity when the salinity was in the range of 0–50; plasma osmolality and ions were significantly higher compared to the control group (salinity 6) and remained steady at salinity of 0–35. Na+/K+–ATPase activity reached its peak at the salinity of 0. Na+/K+–ATPase activities of goby young fishes ingroups with salinity at 25 and 35 were evidently stronger than those in groups with salinity range of 5–20 and of 40–50. There were no significant differences in Na+/K+–ATPase activities between 25 and 35 groups and the differences were also of no statistical significance in groups with salinity range of 5–20 and of 40–50. In salinity range of 5–35, the gill Na+/K+–ATPase activity increased with the ascending of the degree of salinity. Regression analysis showed serum isosmotic point was estimated as 0.308 mol/kg, which corresponded to salinity 10.8. The isoionic point of Na+, Cl–and K+were 340.28 mmol/L, 137.08 mmol/L and 4.51 mmol/L, respectively. which corresponded to salinity 28.1, 8.9 and 18.5. The results indicated that the goby young fish might have a great capability of acclimation to salinity change. It tolerates salinities ranging from 0.3 to 35, and the optimal living salinities were in the range of 5 to 15.

Synechogobius ommaturus; salinity; plasma osmolality; plasma ions; gill Na+/K+–ATPase activity

10.13331/j.cnki.jhau.2014.01.015

時(shí)間：2014– – 00:00

網(wǎng)絡(luò)出版地址：

S965；Q959.483

A

1007?1032(2014)01?0069?05

2013–04–14

國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201203065)；上海市科技興農(nóng)重點(diǎn)攻關(guān)項(xiàng)目(滬農(nóng)科攻字(2011)第1–4號(hào))

稅春(1988—)，男，四川滬州人，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料及魚類生理學(xué)研究，hejiangsc@foxmail.com；

*通信作者，yonghais@163.com