王一光，林羽，陳方永，楊小平*

(1.溫州市農(nóng)業(yè)局特產(chǎn)站，浙江 溫州 325000；2.浙江省柑橘研究所，浙江 臺(tái)州 318020)

楊梅枝條枯萎病原菌分離鑒定及防治藥劑的室內(nèi)篩選

王一光1，林羽1，陳方永2，楊小平1*

(1.溫州市農(nóng)業(yè)局特產(chǎn)站，浙江 溫州 325000；2.浙江省柑橘研究所，浙江 臺(tái)州 318020)

為了查明浙江省溫州市瑞安大面積楊梅枝條枯死的主要原因，采用組織分離法對(duì)枯死的楊梅枝條進(jìn)行病原分離，獲得1種主要真菌分離物HN?01。根據(jù)分離物的培養(yǎng)性狀、孢子大小，結(jié)合顯微鏡檢測(cè)和分子生物學(xué)ITs序列測(cè)定，該菌株被鑒定為聚多擬盤多毛孢(Pestalotiopsis sydowiana)。對(duì)菌株進(jìn)行柯赫氏法則驗(yàn)證，證明聚多擬盤多毛孢是導(dǎo)致楊梅枝條枯死的病原菌。篩選4種殺菌劑對(duì)該病原菌進(jìn)行室內(nèi)毒力測(cè)定，結(jié)果50%咪鮮胺可濕性粉劑的防效較好，EC50值為1.21 mg/L。

楊梅；擬盤多毛孢；ITs序列；室內(nèi)毒力

1 材料與方法

1.1 材 料

從浙江溫州市瑞安楊梅生產(chǎn)基地采集的楊梅枯死枝條。

采用PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、水1 000 mL。

供試藥劑：430 g/L 戊唑醇水分散劑(WG)和50%咪鮮胺可濕性粉劑(WP)(均為拜耳作物科學(xué)公司產(chǎn)品)；80% 代森錳鋅WP(南通德斯益農(nóng)化工有限公司產(chǎn)品)；50%烯酰嗎啉WP (河北恒達(dá)利農(nóng)藥化工有限公司產(chǎn)品)。

1.2 方 法

1.2.1 枯死枝條的癥狀觀察及保濕培養(yǎng)

觀察楊梅枯死枝條及葉片的病部特征，詳細(xì)記錄癥狀特點(diǎn)，用保濕培養(yǎng)法[6]對(duì)枯死枝條及葉片進(jìn)行表面帶菌檢驗(yàn)。

1.2.2 病原菌的分離和純化

病原物的分離參照文獻(xiàn)[7]和[8]的方法進(jìn)行。病原物的純化，主要通過(guò)切取菌絲段或挑取單孢進(jìn)行純培養(yǎng)，純化后的菌種轉(zhuǎn)移到PDA斜面培養(yǎng)基上保存。

1.2.3 分離病原菌的鑒定

培養(yǎng)性狀及形態(tài)學(xué)觀察，根據(jù)分離真菌在PDA培養(yǎng)基上的菌絲生長(zhǎng)情況和孢子顯微形態(tài)鑒定。

病原菌的分子生物學(xué)鑒定，按照文獻(xiàn)[9]的方法進(jìn)行。

1.2.4 柯赫氏法則驗(yàn)證

根據(jù)柯赫氏法則，將純化菌株菌絲塊回接至離體的健康楊梅枝條上，脫脂棉保濕，25 ℃恒溫培養(yǎng)，選取出現(xiàn)相同枯死癥狀的枝條進(jìn)行病原菌的再次分離鑒定。

1.2.5 殺菌劑的室內(nèi)毒力測(cè)定

參照文獻(xiàn)[10]方法進(jìn)行。每種藥劑分別取不同的濃度，在49 mL PDA培養(yǎng)基(55 )℃中加入1 mL藥劑，分別倒入3個(gè)直徑為90 mm的培養(yǎng)皿內(nèi)(3次重復(fù))，靜置30 min后在平板中央放菌餅，于25 ℃下倒置培養(yǎng)6 d，量取各平板中菌落的直徑，與空白對(duì)照比較，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)抑制率[11]和EC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 楊梅枯死枝條癥狀及保濕培養(yǎng)結(jié)果

調(diào)查發(fā)現(xiàn), 楊梅枯死的枝條上有淡褐色圓形病斑，后漸變?yōu)榛尹S色或灰白色。保濕培養(yǎng)后，在枝干和葉片上出現(xiàn)白色絮狀霉層，其上散生粗而稀疏的黑色小點(diǎn)(分生孢子盤) 。

2.2 病原菌分離結(jié)果

對(duì)8份枯死楊梅枝條樣品，分別采用組織分離法進(jìn)行分離和純化，得到1種主要病原分離物，編號(hào)為菌株HN–01(圖1)。根據(jù)分離物的培養(yǎng)性狀、孢子大小，結(jié)合顯微鏡檢測(cè)和分子生物學(xué)ITs序列測(cè)定結(jié)果，該菌株被鑒定為聚多擬盤多毛孢(Pestalotiopsis sydowiana)。

圖1 菌株HN–01的菌落特征Fig. 1 Colony characteristics of strain HN–01

菌株HN–01的菌落在PDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，25 ℃下，6 d能長(zhǎng)滿培養(yǎng)皿，呈云紋狀向外擴(kuò)展，初期至后期均為白色，6 d后，在平板上可見黑色的小顆粒(分生孢子盤)。鏡檢分生孢子呈紡錘形，直或微彎，有4個(gè)隔膜，中間有色細(xì)胞長(zhǎng) 13～16 μm，深橄欖色，上2個(gè)細(xì)胞琥珀色；兩端細(xì)胞無(wú)色，頂生2～3根無(wú)色刺毛。菌株HN–01測(cè)序所得序列全長(zhǎng)為582 bp(圖3)。將菌株的ITs序列與BLAST搜索到的相近菌株進(jìn)行比對(duì)分析，并用MEGA3軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。結(jié)果表明，該菌株與聚多擬盤多毛孢(P. sydowiana)及異色擬盤多毛孢(P. versicolor ) 的ITS序列相似性均達(dá)到99%。但P. versicolor的培養(yǎng)特性和分生孢子特征為：在PDA培養(yǎng)基上，菌落白色絮狀；子實(shí)體墨汁狀，排列比較稀疏，數(shù)量較少，但顆粒特別大；分生孢子異色，上部2個(gè)有色細(xì)胞顏色為茶黃褐色或煤煙黑色，下部1個(gè)有色細(xì)胞顏色為橄欖褐色，大小為15～30 μm[12–14]，與菌株HN–01的特征差異較大，因此，將HN–01菌株鑒定為聚多擬盤多毛孢。

圖2 菌株HN–01的孢子形態(tài)Fig. 2 Spore morphology of strain HN–01

圖3 菌株HN–01的PCR凝膠電泳結(jié)果Fig. 3 Gel electrophoresis of PCR products from strain HN–01

圖4 菌株HN–01的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 Phylogenetic tree of strain HN–01

2.3 柯赫氏法則驗(yàn)證結(jié)果

用純化的菌株回接健康的楊梅枝條，表現(xiàn)出相同的枯死癥狀。從枯死枝條上再分離的菌株在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)特性與純化菌株一致，鏡檢后觀察到相同形態(tài)特征的分生孢子，故判斷引起浙江臺(tái)州市黃巖區(qū)楊梅枝條枯死的病原菌就是聚多擬盤多毛孢。

2.4 殺菌劑的室內(nèi)篩選結(jié)果

室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果表明，4種藥劑對(duì)擬盤多毛孢均有一定的抑制作用，且隨著濃度的增加抑制作用增強(qiáng)，其相關(guān)系數(shù)均在0.95以上(表1)。但不同藥劑之間的抑制作用差異較大，其中50%咪鮮胺WP的抑制作用最強(qiáng)，EC50值為1.21 mg/L；其次是430 g/L戊唑醇WG，EC50值為3.86 mg/L；80%代森錳鋅WP的效果最差。

表1 4種藥劑對(duì)擬盤多毛孢的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果Table 1 Regression equation for toxicity of four kinds of pesticides on P. sydowiana

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責(zé)任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅 維

Isolation, identification of pathogen causing exsciccation of Myrica rubra Sieb.et Zucc branch and screening of control chemicals in laboratory

WANG Yi-guang1, LIN Yu1, CHEN Fang-yong2, YANG Xiao-ping1*
(1.Agricultural Bureau Specialty Station of Wenzhou City, Wenzhou, Zhejiang 325000, China; 2.Citrus Research Institute of Zhejiang Province, Taizhou, Zhejiang 318020, China)

To find out the main cause of dead branches of Myrica rubra Sieb.et Zucc at Wenzhou ruian, zhejiang province, tissue isolation was conducted on dead branches and one fungal isolate HN-01 was separated. According to the morphological characteristics, spore size, microscopy and the sequence of the internal transcribed spacer (ITs), the strain HN-01 was identified as Pestalotiopsis sydowiana. Based the rule of Koch's postulation, P. sydowiana was proved to be the pathogen causing the exsciccation of myrica sp. branches. Four major fungicides were screened against the pathogen in laboratory and 50% prochloraz WP had good control effect with 50% effective concentration value of 1.21 mg/L.

Myrica rubra Sieb.et Zucc; pestalotiopsis sydowiana; identification; ITs sequence; indoor toxicity

10.13331/j.cnki.jhau.2014.01.011

時(shí)間：2014– – 00:00

網(wǎng)絡(luò)出版地址：

S436.639

A

1007?1032(2014)01?0054?03

楊梅(Myrica rubra Sieb.et Zucc)果實(shí)酸甜適中，具有獨(dú)特風(fēng)味[1]。隨著楊梅種植面積的擴(kuò)大，危害楊梅的病害逐漸增多，嚴(yán)重影響了楊梅的產(chǎn)量和品質(zhì)。這些病害主要包括干枯病(Myxosporium corticola Rostr.)、褐斑病(Mycosphaerela myricae Saw.)、赤衣病(Corticim saimonicolor Berk.)、炭疽病(Glomerella mume (Hori) Hemmi)和枝腐病(Valsa coronata (Hoffm)Fr.)等[2–5]。浙江省溫州市瑞安是許多楊梅主栽品種的原產(chǎn)地。近年來(lái)，多次發(fā)現(xiàn)楊梅不明原因的枝條枯死，而且施用多菌靈、代森錳鋅等多種殺菌劑均沒(méi)有效果。為弄清該地區(qū)楊梅枝條枯萎病病原種類，筆者采用組織分離法對(duì)枯死的楊梅枝條進(jìn)行病原分離，獲得了1種主要真菌分離物HN–01，并進(jìn)行了鑒定。為有效防治該病，篩選4種殺菌劑進(jìn)行了室內(nèi)毒力測(cè)定。

2013–05–05

溫州市科技局項(xiàng)目(N20100001)

王一光(1963—)，男，浙江溫州人，高級(jí)農(nóng)藝師，主要從事經(jīng)濟(jì)作物病害研究，1976503032@qq.com；*通信作者，1920951534@qq.com