尚 辰,楊濱州,張 育,沈維干

(揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 風(fēng)濕免疫科,江蘇 揚(yáng)州,225001)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性、系統(tǒng)性的自身免疫性疾病，其特征是多關(guān)節(jié)的慢性炎癥，進(jìn)行性的骨與軟骨破壞。該病在中國(guó)的患病率達(dá)0.32%～0.36%,是造成中國(guó)勞動(dòng)力喪失和致殘的主要疾病之一。據(jù)文獻(xiàn)[1]報(bào)道,35% RA患者在10年內(nèi)喪失工作能力。隨著對(duì)RA發(fā)病機(jī)制研究的深入，一些新的治療方法能很好地控制RA的炎癥。但如何有效預(yù)防和干預(yù)RA患者關(guān)節(jié)破壞，促進(jìn)骨修復(fù)，改善患者的生活質(zhì)量，仍然是RA研究的熱點(diǎn)。

來(lái)源于造血干細(xì)胞的破骨細(xì)胞過(guò)度分化和活化在RA骨破壞進(jìn)程中起著至關(guān)重要的作用。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，核因子κB 受體活化因子配體(RANKL)/核因子κB受體活化因子(RANK)/骨保護(hù)素(OPG) 系統(tǒng)與破骨細(xì)胞分化及活化過(guò)程密切相關(guān)。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)能夠向炎癥和損傷部位“歸巢”，具有自我增殖、免疫調(diào)節(jié)和修復(fù)等功能[2],該特性和功能可能在RA骨破壞的修復(fù)中起到積極作用。

雌激素通過(guò)與雌激素受體結(jié)合而活化雌激素受體介導(dǎo)的信號(hào)通路來(lái)調(diào)控BM-MSCs的增殖和相關(guān)功能[3-4]。金雀異黃素(Gen)具有與雌激素相同的結(jié)構(gòu)，藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其除了弱雌激素作用外，還具有其他藥理作用，如抗癌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)及調(diào)節(jié)心血管系統(tǒng)等作用[5-6]。本研究前期已證實(shí)Gen能抑制RA大鼠關(guān)節(jié)的破壞[7],本文進(jìn)一步觀察Gen對(duì)RA患者BM-MSCs中RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)的影響，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

RA患者來(lái)源于揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院風(fēng)濕免疫科，符合1987年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)(ACR)的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)，疾病處于高度活動(dòng)期。健康對(duì)照組性別、年齡與RA組相匹配，無(wú)其他自身免疫性疾病，無(wú)心血管疾病、代謝性疾病、退行性疾病、血液病、腫瘤及遺傳病等可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的疾病。

1.2 主要試劑、儀器及來(lái)源

Gen(上海融合醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司),Ficoll淋巴細(xì)胞分離液(天津市灝洋生物科技有限公司)，低糖DMEM培養(yǎng)液(Hyclone公司)，胎牛血清(Gibco公司)，鼠抗人CD34-PE單克隆抗體、鼠抗人CD45-PE-Cy5單克隆抗體、鼠抗人CD29-PE單克隆抗體、鼠抗人CD90-FITC單克隆抗體(Becton Dickinson公司)，兔抗人RANKL多克隆抗體、兔抗人ER α多克隆抗體、兔抗人OPG多克隆抗體、兔抗人RANK多克隆抗體(Santa Cruz公司)，山羊抗兔IgG-HRP(上?？党缮锕こ逃邢薰?，山羊抗兔IgG-FITC(武漢博士德生物工程有限公司)，雌激素受體拮抗劑ICI182710(Toc-ris公司)，雌二醇(E2)(大連美侖生物技術(shù)有限公司)，熒光顯微鏡(Olympus公司)，電泳儀、垂直電泳槽、轉(zhuǎn)印槽(Bio-rad公司)，酶標(biāo)儀(Bio-Tek公司)，流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson公司)，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(ALPHA公司)。

1.3 BM-MSCs的分離、培養(yǎng)

髂后上棘取骨髓 5 mL,置于含0.5 mL肝素鈉(100 U/mL)的無(wú)菌小瓶，混勻，加入5 mL無(wú)血清DMEM培養(yǎng)液，制成細(xì)胞懸液。將細(xì)胞懸液置于等體積Ficoll分離液上,2 500 r/min離心30 min,吸取界面層，加入5倍體積的PBS,混勻,1 000 r/min離心8 min,PBS洗滌2次。DMEM培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后重懸于含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液中，按1×105/mL的密度接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。48 h后半量更換培養(yǎng)液，以后每3 d換液1次。待細(xì)胞匯合接近80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化、傳代，至第三代備用。用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)情況。

1.4 BM-MSCs的鑒定

取傳代后的第3代BM-MSCs,培養(yǎng)至80%匯合時(shí)，胰蛋白酶消化細(xì)胞，用含10% FBS的培養(yǎng)液中和,1 500 r/min離心15 min,收集細(xì)胞,PBS洗滌3次，制成 1×105/mL細(xì)胞懸液。各取100 μL細(xì)胞懸液分別加入熒光標(biāo)記的抗人CD34、CD45、CD25、CD90抗體標(biāo)記，室溫孵育30 min,另設(shè)空白對(duì)照管，流式細(xì)胞儀鑒定。

1.5 Western Blot檢測(cè)RANK、RANKL、OPG的表達(dá)

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)MTT結(jié)果,Gen在濃度為1 μmol/L時(shí)對(duì)BM-MSCs無(wú)細(xì)胞毒性作用，所以作者選用1 μmol/L作為實(shí)驗(yàn)終濃度。實(shí)驗(yàn)分為4組：空白對(duì)照組(Con組，未處理)、Gen處理組(Gen組,1 μmol/L)、雌二醇處理組(E2組,0.01 μmol/L)和Gen+雌激素受體拮抗劑組(Gen+ICI組,Gen 1 μmol/L、ICI182710 0.1 μmol/L)。取傳代后第3代的正常人與RA患者的BM-MSCs,按分組加入藥物處理96 h后，提取細(xì)胞總蛋白，進(jìn)行蛋白定量,SDS-PAGE,轉(zhuǎn)膜，一抗(RANKL、OPG工作濃度1∶200,RANK工作濃度1∶100,GAPDH工作濃度1∶4 000)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗(1∶4 000)室溫孵育2 h,ECL試劑盒顯色，化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)獲得Western條帶，以GAPDH 為參照，ImageJ2x軟件對(duì)條帶吸光度值進(jìn)行分析。

1.6 免疫熒光法免疫熒檢測(cè)雌激素受體α(ERα)細(xì)胞內(nèi)分布情況

取傳代后的RA患者第3代BM-MSCs,分為Con組、Gen組、E2組，每組按5×104/孔濃度接種于覆蓋蓋玻片的24孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48 h后，取出蓋玻片,PBS洗滌2次,4%多聚甲醛固定15 min,PBS洗滌3次,0.5% Triton處理15 min,PBS洗滌3次,3%牛血清白蛋白封閉1 h,加入兔抗人ER α抗體(1∶200),置于濕盒中4 ℃過(guò)夜后,PBS洗3次，加入山羊抗兔IgG-FITC (1∶50)室溫孵育2 h,PBS洗滌3次，加入DAPI染色10 min,PBS洗滌3次，封片，于熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察以及細(xì)胞表型鑒定

倒置相差顯微鏡下觀察結(jié)果顯示,RA患者的BM-MSCs傳代后的細(xì)胞形態(tài)與成纖維細(xì)胞形態(tài)相似，呈長(zhǎng)梭形，排列規(guī)則 (見(jiàn)圖1),符合人BM-MSCs的形態(tài)特征。流式細(xì)胞儀檢測(cè)第3代BM-MSCs中CD90陽(yáng)性細(xì)胞率為99.7%,CD29陽(yáng)性細(xì)胞率為99.9%,CD34陽(yáng)性細(xì)胞率為0.9%,CD45陽(yáng)性細(xì)胞率為1.8%(見(jiàn)圖2),符合BM-MSCs的基本特征標(biāo)志，正常人的BM-MSCs的細(xì)胞形態(tài)及鑒定與RA患者的BM-MSCs特征是一致的。

圖1 生長(zhǎng)匯合的RA患者的BM-MSCs 100倍

圖2 流式細(xì)胞儀檢測(cè)RA患者BM-MSCs表面抗原結(jié)果

2.2 Gen顯著上調(diào)BM-MSCs中OPG的表達(dá)

用Western blot方法檢測(cè)BM-MSCs中RANK、RANKL和OPG的蛋白表達(dá)水平，實(shí)驗(yàn)結(jié)果由圖3和圖4所示。與正常人BM-MSCs相比，RA患者BM-MSCs中的RANK的蛋白表達(dá)水平明顯升高,OPG的蛋白表達(dá)水平明顯降低，數(shù)據(jù)分析顯示RANKL/OPG比值升高，提示BM-MSCs中RANK/RANKL/OPG表達(dá)改變可能在RA骨質(zhì)破壞的病理進(jìn)程起著重要作用。Gen可以顯著上調(diào)正常人BM-MSCs中的OPG的蛋白表達(dá)(P<0.05),對(duì)RANK、RANKL的表達(dá)無(wú)明顯影響(P>0.05),效果與E2類似；數(shù)據(jù)分析表明Gen可以降低RANKL/OPG比值; Gen聯(lián)合雌激素受體拮抗劑處理正常人BM-MSCs后，與Gen組和E2組相比OPG蛋白表達(dá)降低(P<0.05),與Con組相比略有升高但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3)。Gen同樣可顯著上調(diào)RA患者BM-MSCs中的OPG蛋白表達(dá)(P<0.05),對(duì)RANK、RANKL表達(dá)也無(wú)明顯影響(P>0.05),效果與E2類似；同時(shí)，數(shù)據(jù)分析也顯示Gen可降低RANKL/OPG比值; Gen聯(lián)合雌激素受體拮抗劑處理RA患者的BM-MSCs后，與Gen組和E2組相比OPG蛋白表達(dá)水平有所降低(P<0.05),但其表達(dá)水平仍高于Con組 (P<0.05)(圖4)。

2.3 Gen可以促進(jìn)RA患者BM-MSCs的ERα入核

Gen作用RA患者BM-MSCs 48 h后，免疫熒光檢測(cè)ERα細(xì)胞內(nèi)分布情況。結(jié)果顯示: Gen與E2可顯著促進(jìn)ERα進(jìn)入細(xì)胞核(圖5),提示Gen可能通過(guò)與ERα結(jié)合，促進(jìn)ERα進(jìn)入細(xì)胞核。

A: RANK、RANKL、OPG、GAPDH的蛋白表達(dá)水平; B: 對(duì)應(yīng)的RANK、RANKL、OPG相對(duì)于GAPDH灰度值比值; C: 各處理組RANKL/OPG比值。與Con組比較,△P<0.05。

A: RANK、RANKL、OPG、GAPDH的蛋白表達(dá)水平; B: 對(duì)應(yīng)的RANK、RANKL、OPG相對(duì)于GAPDH灰度值比值; C: 各處理組RANKL/OPG比值。與Con組比較,△P<0.05; 與Gen組和E2組比較,*P<0.05。

圖5 Gen促進(jìn)RA患者BM-MSCs的ERα入核

3 討 論

關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)疏松和全身骨質(zhì)流失在RA患者中甚為常見(jiàn)。炎癥因子破壞骨髓微環(huán)境對(duì)BM-MSCs造成損傷是RA導(dǎo)致病理性骨質(zhì)疏松的重要原因[8]。BM-MSCs作為骨髓微環(huán)境中的重要細(xì)胞組分，表達(dá)多種具有造血細(xì)胞調(diào)控能力的細(xì)胞因子，通過(guò)直接或間接的方式調(diào)控造血細(xì)胞的分化與成熟。成骨細(xì)胞起源于BM-MSCs[9]，破骨細(xì)胞起源于造血干細(xì)胞，骨髓微環(huán)境中RANKL/OPG可能決定了破骨細(xì)胞的分化和成熟[10-11]。RA骨質(zhì)破壞可能是由于骨髓微環(huán)境中的成骨細(xì)胞分化受到抑制，破骨細(xì)胞過(guò)度分化成熟所致[8]。這些研究結(jié)果提示了BM-MSCs在RA的骨質(zhì)破壞中起著重要作用。本研究選擇正常人和RA患者的BM-MSCs為研究對(duì)象，通過(guò)分離培養(yǎng)得到正常人和RA患者的BM-MSCs,顯微鏡觀察顯示細(xì)胞呈成纖維樣、漩渦狀生長(zhǎng)，符合BM-MSCs的形態(tài)特點(diǎn)，表面抗原CD29、CD90陽(yáng)性率超過(guò)95%,CD34、CD4陽(yáng)性率低于2%,符合BM-MSCs基本特征標(biāo)志，可用于本實(shí)驗(yàn)研究。

RANKL/OPG/RANK系統(tǒng)在骨重建中起著重要作用，通過(guò)RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)介導(dǎo)的破骨細(xì)胞造成的骨質(zhì)破壞在RA的病理進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[12]。有研究[13]顯示,RA患者血清、關(guān)節(jié)滑液中OPG水平降低,RANKL/OPG比值升高。而RANKL/OPG的平衡決定了破骨細(xì)胞活化和增殖的水平[10],因此RA患者RANKL/OPG比值升高可能介導(dǎo)了骨質(zhì)破壞。本組研究發(fā)現(xiàn)，與正常人BM-MSCs相比,RA患者BM-MSCs中的RANK的蛋白表達(dá)水平明顯升高,OPG的蛋白表達(dá)水平明顯降低，數(shù)據(jù)分析顯示其RANKL/OPG比值升高。本研究前期已發(fā)現(xiàn)Gen可抑制CIA大鼠的骨質(zhì)破壞[7],考慮到BM-MSCs在RA的骨質(zhì)破壞中起著重要作用，因此本文在體外細(xì)胞水平進(jìn)一步探討Gen是否通過(guò)對(duì)BM-MSCs中RANK/RANKL/OPG系統(tǒng)的調(diào)控而起到抑制RA骨質(zhì)破壞的作用。研究結(jié)果表明，Gen可顯著上調(diào)RA患者BM-MSCs的OPG蛋白表達(dá)，而對(duì)RANK、RANKL蛋白表達(dá)無(wú)明顯影響，提示Gen可能通過(guò)調(diào)控RA患者的BM-MSCs中OPG的表達(dá)，降低RANKL/OPG的比值，從而抑制破骨細(xì)胞過(guò)度活化和分化，最終抑制RA患者關(guān)節(jié)骨質(zhì)破壞。

Gen是一種植物雌激素，可能通過(guò)雌激素樣作用在卵巢切除小鼠骨質(zhì)疏松模型中影響骨質(zhì)代謝[14]。本研究結(jié)果顯示,Gen和E2對(duì)RANK/RANKL/OPG表達(dá)的影響類似；同時(shí)免疫熒光結(jié)果顯示: Gen可顯著促進(jìn)RA患者的BM-MSCs中ERα入核，提示Gen可能通過(guò)促進(jìn)ERα入核，活化ERα介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路，上調(diào)OPG的表達(dá)，進(jìn)而影響RANKL/OPG的比值。為進(jìn)一步驗(yàn)證Gen是否通過(guò)活化ERα介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路起作用，本文使用Gen聯(lián)合雌激素受體拮抗劑ICI182710處理BM-MSCs,Western Blot結(jié)果顯示與Gen組和E2組相比，其OPG蛋白表達(dá)水平降低，但與Con組相比，其OPG蛋白表達(dá)水平升高,Gen促進(jìn)OPG蛋白表達(dá)的作用并沒(méi)有被完全抑制。這些結(jié)果提示Gen除了通過(guò)活化ERα介導(dǎo)的相關(guān)信號(hào)通路影響RANKL/OPG的比值，可能還通過(guò)其他信號(hào)通路發(fā)揮調(diào)控作用。

[1]Allaire S,Wolfe F,Niu J,et al.Contemporary prevalence and incidence of work disability associated with rheumatoid arthritis in the US [J].Arthritis Rheumatism,2008,59(4): 474.

[2]Uccelli A,Moretta L,Pistoia V.Mesenchymal stem cells in health and disease [J].Nat Rev Immunol,2008,8(9): 726.

[3]Cha Y,Kwon S J,Seol W,et al.Estrogen receptor-alpha mediates the effects of estradiol on telomerase activity in human mesenchymal stem cells [J].Mol Cells,2008,26(5): 454.

[4]Erwin G S,Crisostomo P R,Wang Y,et al.Estradiol-treated mesenchymal stem cells improve myocardial recovery after ischemia[J].J Surg Res,2009,152(2): 319.

[5]Zhao R,Xiang N,Domann F E,et al.Effects of selenite and genistein on G2/M cell cycle arrest and apoptosis in human prostate cancer cells[J].Nutr cancer,2009,61(3): 397.

[6]Reiter E,Reiter E,Beck V,et al.Isoflavones are safe compounds for therapeutical applications-evaluation of in vitro data [J].Gynecol Endecrinol,2009,25(9): 554.

[7] 許金鑫,張育,張學(xué)增,等.金雀異黃素對(duì)CIA 大鼠炎癥及細(xì)胞因子影響的研究[J].實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志,2010,14(19): 1.

[8] Kotake S,Nanke Y.Effect of TNFα on osteoblastogenesis from mesenchymal stem cells [J].Biochim Biophys Acta,2014,1840(3): 1209.

[9]Pittenger M F,Mackay A M,Beck S C,et al.Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells[J].Science,1999,284(5411): 143.

[10]Ando K,Mori K,Rédini F,et al.RANKL /RANK/OPG: key therapeutic target in bone oncology[J].Curr Drug Discov Technol,2008,5(3): 263.

[11]Coetzee M,Kruger M C.Osteoprotegerin-receptor activator of nuclear factor-kappaB ligand ratio: a new approach to osteoporosis treatment[J].South Med J,2004,97(5): 506.

[12]Neumann E,Gay S,Müller-Ladner U.The RANK/RANKL/Osteoprotegerin System in Rheumatoid Arthritis: New Insights From Animal Models[J].Arthritis Rheum,2005,52(10): 2960.

[13]樊秋貴,郭鈞,楊民.OPG RANKL RANK等因子在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者血清及滑膜液中的變化及意義[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2007,11(1): 38.

[14]Hertrampf T,Gruca M J,Seibel J,et al.The bone-protective effect of the phytoestrogen genistein is mediated via ER alpha-dependent mechanisms and strongly enhanced by physical activity[J].Bone,2007,40(6): 1529.