張 虹,范宏濤,和 芳,馬 莎,晉 松

(云南省第一人民醫(yī)院 風濕免疫科,云南 昆明,650000)

干燥綜合征(SS)是一種自身免疫性疾病，主要侵犯唾液腺、淚腺等外分泌腺，病理表現(xiàn)主要是外分泌腺的淋巴細胞浸潤，血清中可檢出多種自身抗體，當該病不伴有其他自身免疫性疾病時，被稱為原發(fā)性干燥綜合征(PSS)[1]。大量研究[2-3]表明,PSS患者外周血的T細胞各亞群的表達水平與健康人群存在差異，尤其是調(diào)節(jié)性T細胞(Treg細胞)在維持自身免疫耐受、抑制致病性免疫細胞增殖方面發(fā)揮重要作用。本研究對照了32例PSS患者及35例健康人的外周血T細胞亞群測定結(jié)果，嘗試探討T細胞亞群表達水平在PSS發(fā)病過程中的意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取本院2010年1月—2013年12月初次診斷為PSS的患者32例，其中男17例，女15例，年齡32～40歲，平均年齡(41.25±2.19)歲。另隨機選取本院健康體檢者35例，男18例，女17例，年齡30～41歲，平均年齡(42.08±3.17)歲。2組患者在年齡、性別等一般資料方面無顯著差異(P>0.05),具有可比性。納入標準：以2012年美國風濕病學會干燥綜合征分類標準[4]為依據(jù)，滿足口腔癥狀、眼部癥狀、眼部體征、組織學檢查、唾液腺受損及自身抗體等診斷條件。排除標準: ① 患有腫瘤者; ② 同時患有其他自身免疫性疾病者; ③ 有近期感染史者。

1.2 試劑與儀器

采用EPICS XL流式細胞儀，雙標記單克隆抗體CD3/CD16+CD56-PE,CD4-FITC,CD25-PE,三標記單克隆抗體CD3-PC5/D4-FITC/CD8-PE，以上儀器及試劑均購自美國BECKMAN COULTER公司。

1.3 檢測方法

晨起抽取2組患者靜脈血，設(shè)置試驗試管及陰性對照試管后，分別加入肝素抗凝血50 μL,再加入CD4-FITC和CD25-PE各10 μL,在對照試管中加入IgGl-FITC和IgG2a-PE各10 μL,室溫放置20 min,分別加入溶血劑250 μL,室溫避光放置15 min后加入磷酸鹽緩沖液(PBS)250 μL,再放置15 min后，采用PBS洗滌2次，加PBS 500 μL之后進行上機檢測。

1.4 觀察指標

比較2組CD3+、CD3+CD4+CD8-、CD3+CD4-CD8+、CD3+CD4-CD8-及CD4+CD25+high表達水平。

2 結(jié) 果

2組患者的CD3+、CD3+CD4-CD8+水平無顯著差異(P>0.05)，觀察組的CD4+/CD8+、CD3+CD4+CD8-亞群的比例較觀察組有明顯升高(P<0.01),CD3+CD4-CD8-雙陰性T細胞與 CD4+CD25+high亞群的比例較觀察組顯著下降(P<0.01),見表1，圖1、圖2。

表1 2組患者的T細胞亞群表達水平比較 %

圖1 1例健康人外周血CD4+CD25+high的表達

3 討 論

圖2 1例PSS患者外周血CD4+CD25+high的表達

SS是一種自身免疫性炎癥性疾病，其主要特點是外分泌腺中的淋巴細胞浸潤、破壞，以及血清中存在多種自身抗體，該病在中國的發(fā)病率為0.29%～0.77%，女性為多，發(fā)病年齡大多在40～60歲，其中PSS的發(fā)病機制尚不完全明確。

目前研究[1]認為,PSS的發(fā)病與環(huán)境因素、唾液腺上皮細胞破壞、T淋巴細胞及其亞群的時常，以及B淋巴細胞的過度反應(yīng)等有關(guān)。近年來,T細胞亞群的變化與PSS發(fā)病之間的關(guān)系成為該領(lǐng)域的研究熱點。國外有研究[5-6]表明,PSS的發(fā)病可能與T細胞亞群的異常變化有關(guān)，免疫病理檢查發(fā)現(xiàn)，患者的外分泌腺中浸潤的主要是T細胞，這些細胞的異常會導致外分泌腺導管以及上皮細胞的退化、萎縮和破壞，導致患者出現(xiàn)口干、眼干等相關(guān)癥狀[7]。

自從1995年Sakaguchi等首次報道了CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞以來，這一類T細胞亞群與PSS發(fā)病之間的關(guān)系受到了廣泛關(guān)注。CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞具有免疫負性調(diào)節(jié)功能，它特異性地表達一種轉(zhuǎn)錄因子FoxP3,可以通過IL-10等細胞因子發(fā)揮其抗炎和維持自身免疫耐受狀態(tài)的作用[8]。朱建東等[9]對比60例PSS患者及30例正常人的外周靜脈血發(fā)現(xiàn)，前者的血清IL-10水平顯著低于后者,IL-17水平則顯著高于后者，而IL-10主要由CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞分泌，發(fā)揮免疫抑制的作用，這一結(jié)果提示調(diào)節(jié)性T細胞的數(shù)量及功能下降，導致分泌的抑制性細胞因子減少，抑制能力出現(xiàn)相應(yīng)的下降，導致激活的自身反應(yīng)性T淋巴細胞增多，這一系列過程可能參與了PSS的發(fā)病過程。覃羽華等[10]研究發(fā)現(xiàn)，在PSS患者中，其外周血的CD4+/CD8+比例顯著高于正常人，而CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞則顯著降低，提示PSS患者存在明顯的致病性CD4+升高，而CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞的降低則使得機體免疫耐受狀態(tài)遭到破壞。調(diào)節(jié)性T細胞有兩個來源，即胸腺和外周，但外周來源的調(diào)節(jié)性T細胞的具體分化機制目前還不清晰，依據(jù)其功能推測，當人體內(nèi)調(diào)節(jié)性T細胞數(shù)量減少時，人體對自身抗原的敏感性會相應(yīng)增強，這時人體就更易發(fā)生自身免疫類疾病。值得關(guān)注的是，有多項研究表明,CD25低表達的細胞可能并不具有調(diào)節(jié)功能，而只有CD25高表達的細胞才是真正的調(diào)節(jié)性T細胞，即CD4+CD25+high亞群細胞才具有調(diào)節(jié)作用[11-12]。鄭紅霞等[13]采用流式細胞儀檢測了25例PSS患者外周血的CD4+CD25+highT細胞水平，與20例正常人進行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PSS患者的CD4+CD25+highT細胞所占的比例顯著低于正常人，并且與病情活動相關(guān)性指標，如C反應(yīng)蛋白、IgG等呈負相關(guān)趨勢，提示CD4+CD25+highT細胞與PSS的發(fā)病具有一定關(guān)系，且與病情的活動性相關(guān)。此外，李冬梅等[14]研究表明，CD3+CD4-CD8-雙陰性T細胞在體外激活后，可產(chǎn)生IL-4、IL-19等細胞因子，或者與靶細胞直接接觸，最終導致靶細胞凋亡，提示CD3+CD4-CD8-雙陰性T細胞具有自身免疫負調(diào)控的作用。因此，本研究在檢測調(diào)節(jié)性T細胞亞群的表達水平時，選取了具有代表性的CD3+CD4-CD8-雙陰性T細胞及CD4+CD25+high調(diào)節(jié)性T細胞作為檢測指標。

本研究結(jié)果顯示，2組人員的CD3+及CD3+CD4-CD8+的百分比無顯著差異，提示這兩個亞群可能沒有參與PSS的發(fā)病過程，而PSS患者CD4+/CD8+、CD3+CD4+CD8-亞群的表達水平較觀察組有明顯升高，與上述文獻報道一致，該結(jié)果表明有致病性的CD4+T細胞浸潤，而CD4+/CD8+比值的升高，一方面有利于機體產(chǎn)生自身免疫性疾病的抗體，一方面也提示了機體自身的免疫調(diào)節(jié)功能處于紊亂狀態(tài)，同時，自身抗體的產(chǎn)生可能會引發(fā)唾液腺和淚腺的腺泡、腺體的損傷。本研究結(jié)果還表明,PSS患者的CD3+CD4-CD8-雙陰性T細胞及CD4+CD25+high亞群細胞的表達水平較正常人顯著下降，其對自身反應(yīng)性T細胞的負調(diào)控作用也隨之降低，從而使機體發(fā)生自身免疫性疾病的可能性增加，也與上述文獻報道一致。

綜上所述，本研究的結(jié)果提示，T細胞亞群的異常變化在PSS患者的發(fā)病過程中可能起到一定作用，尤其是CD4+CD25+high亞群的降低，會導致機體自身免疫抑制作用的下降，更加容易發(fā)生PSS。但本研究的臨床樣本偏小，有待增加樣本量，進一步觀察研究。

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