王超 邢邯英 王杏 劉敏 張哲

·論著·

通心絡(luò)膠囊抑制NF-κB通路抑制糖尿病視網(wǎng)膜病變小鼠黏附分子的作用

王超 邢邯英 王杏 劉敏 張哲

目的觀察通心絡(luò)膠囊抑制NF-κB通路抑制糖尿病視網(wǎng)膜病變小鼠黏附分子的作用。方法KK/Upj-Ay小鼠隨機分為模型組、通心絡(luò)高、中、低(生藥4、2、1 g/kg)劑量組，另設(shè)C57BL/6小鼠對照組。灌胃給藥3個月，測定血-視網(wǎng)膜屏障功能；流式測定血液中細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)含量；Real Time PCR(qPCR)和Western blot法測定視網(wǎng)膜ICAM-1、VCAM-1和核因子-κB(NF-κB)表達。結(jié)果通心絡(luò)中、高劑組EB含量比模型組明顯下降(P<0.01)；通心絡(luò)中、高劑組血清ICAM-1、VCAM-1含量顯著下降(P<0.05)；通心絡(luò)組ICAM-1、VCAM-1 mRNA及蛋白表達均顯著下降(P<0.01)；通心絡(luò)中、高組核NF-κB表達顯著下降(P<0.05)；總NF-κB mRNA及蛋白表達在各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論通心絡(luò)膠囊可抑制NF-κB通路抑制糖尿病視網(wǎng)膜病變小鼠黏附分子，改善糖尿病視網(wǎng)膜病變。

通心絡(luò)膠囊；糖尿病視網(wǎng)膜病變；黏附分子；NF-κB通路

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是一種具有特異性改變的眼底病變，是臨床糖尿病患者失明的主要原因，每年呈上升趨勢，但并無確切療效的藥物上市[1]。DR 發(fā)生機制復(fù)雜，持續(xù)性高糖、血液-視網(wǎng)膜屏障受損、炎性反應(yīng)等各種因素均會引起DR的發(fā)生[2]。在DR發(fā)生早期，在黏附分子介導(dǎo)下，白細(xì)胞黏附于視網(wǎng)膜血管，引起內(nèi)皮細(xì)胞受損，導(dǎo)致血液-視網(wǎng)膜屏障被破壞，從而引發(fā)了DR發(fā)生[3]。文獻報道通心絡(luò)能改善血管內(nèi)皮功能，治療DR[4]，但其具體機制尚不明確。本實驗采用自發(fā)性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠為DR模型，觀察通心絡(luò)膠囊對KK/Upj-Ay小鼠黏附分子的影響，并初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物：自發(fā)性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠，12周齡，雄性，30～40 g；C57BL/6小鼠，雄性，25～30 g，購于北京華阜康生物科技公司，生產(chǎn)許可證號：SCXK-(京)2009-0002。

1.1.2 藥物、試劑與儀器：通心絡(luò)膠囊購于石家莊以嶺藥業(yè)；細(xì)胞間黏附分子-1(ICAM-1)、血管細(xì)胞黏附分子-1(VCAM-1)引物、核因子-κB(NF-κB)由上海生工生物技術(shù)公司合成；ICAM-1、VCAM-1和NF-κB一抗購自abcam公司。7300 Real-Time PCR System儀，購于ABI公司；Biorad凝膠成像分析儀，購于Biorad公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 小鼠分組：按KK/Upj-Ay空腹血糖值(FBG)分為模型組、通心絡(luò)高劑組、通心絡(luò)中劑組、通心絡(luò)低劑組，另設(shè)C57BL/6小鼠為對照組，每組10只。每組小鼠灌胃給藥，通心絡(luò)高劑組、通心絡(luò)中劑組、通心絡(luò)低劑組分別給予生藥4、2、1 g/kg的通心絡(luò)膠囊，模型組和對照組灌胃等體積的蒸餾水，1次/d，自由飲食飲水，連續(xù)3個月。

1.2.2 FBG測定：實驗結(jié)束后眼球取血，測定FBG。

1.2.3 血-視網(wǎng)膜屏障的測定：給藥結(jié)束，每組取其中6只小鼠尾靜脈注射50 mg/kg伊文思藍(EB)溶液，2 h后小鼠麻醉，灌注4%多聚甲醛緩沖液，灌注壓力80 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，灌注4 min后摘除眼球，分離視網(wǎng)膜，稱量。將視網(wǎng)膜放入150 μl甲酰胺，37℃孵育12 h，3 000 r/min離心10 min，取上清置96孔酶標(biāo)板，620 nm處測定OD值。EB濃度結(jié)果表示為ng/mg。

1.2.4 流式檢測小鼠全血中ICAM-1、VCAM-1的含量：取小鼠全血，分離外周血單個核細(xì)胞，加入PMA和離子霉素刺激淋巴細(xì)胞，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞，Exp32軟件獲取分析細(xì)胞，每個檢測獲取10 000個細(xì)胞，分析ICAM-1、VCAM-1的表達。

1.2.5 Real Time PCR方法測定小鼠視網(wǎng)膜ICAM-1、VCAM-1和NF-κB mRNA的表達：取小鼠視網(wǎng)膜，常規(guī)方法提取組織RNA，鑒定，按試劑盒說明書進行Real Time PCR擴增，以GAPDH作為內(nèi)參照。ICAM-1引物：上游：5’- TTCCGCTACCATCACCGTGT -3’，下游：5’- AGGTCCTTGCCTACTTGCTG -3’，產(chǎn)物片段84 bp；VCAM-1引物：上游：5’-GGGAGACCTGTCACTGTCAACT-3’，下游：5’-GGACTTTATGCCCATTTCCTC-3’，產(chǎn)物片段129 bp；GAPDH引物：上游：5’-TGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3’，下游：5’-TGCTGAGTATGTCG TGGAGTC-3’，產(chǎn)物片段143 bp。用儀器自帶軟件分析，將對照組設(shè)置為1，以對照組進行比較后的相對定量值為目的基因表達。

1.2.6 Western blot法檢測小鼠視網(wǎng)膜ICAM-1、VCAM-1和NF-κB蛋白的表達：取小鼠視網(wǎng)膜，加裂解液提取視網(wǎng)膜組織總蛋白或核蛋白，加入稀釋合適濃度的TNF-α、IL-6、IL-1β、ICAM-1抗體，化學(xué)發(fā)光法顯色。以β-actin作為內(nèi)參，掃描后對條帶進行吸光度積分分析，以目的蛋白吸光度值/β-actin吸光度值的比值為目的蛋白表達。

2 結(jié)果

2.1 5組小鼠FBG的變化 與對照組比較，模型組小鼠FBG值明顯升高(P<0.01)，通心絡(luò)給藥后12周FBG與模型組有下降的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 5組小鼠FBG的變化

組別 FBG藥前第12周對照組5.3±0.85.5±0.9模型組14.8±2.7*17.5±2.8*通心絡(luò)低劑組14.7±2.816.5±2.4通心絡(luò)中劑組14.6±2.615.8±1.9通心絡(luò)高劑組14.9±2.315.0±2.3

注：與對照組比較，*P<0.01

2.2 5組EB含量的變化 與對照組比較，模型組EB含量明顯升高(P<0.01)，通心絡(luò)中、高劑組EB含量比模型組明顯下降(P<0.01)。見表2。

表2 5組小鼠EB含量的變化

組別EB含量對照組12.6±2.6模型組25.5±3.6*通心絡(luò)低劑組20.8±3.9通心絡(luò)中劑組16.4±2.6#通心絡(luò)高劑組16.1±2.4#

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.01

2.3 5組血液中ICAM-1、VCAM-1含量的變化 模型組ICAM-1、VCAM-1含量明顯高于對照組(P<0.01)，與模型組比較，通心絡(luò)中、高劑組ICAM-1、VCAM-1含量顯著下降(P<0.05)。見表3。

表3 5組小鼠ICAM-1、VCAM-1含量的變化

組別ICAM-1VCAM-1對照組0.33±0.060.60±0.10模型組7.50±1.10*5.80±0.56*通心絡(luò)低劑組6.97±0.714.30±0.50#通心絡(luò)中劑組4.20±0.80#3.50±0.52#通心絡(luò)高劑組3.20±0.66△3.43±0.35△

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，△P<0.01

2.4 5組視網(wǎng)膜ICAM-1、VCAM-1和NF-κB表達的變化 模型組ICAM-1、VCAM-1 mRNA及蛋白表達明顯高于對照組(P<0.01)，與模型組比較，通心絡(luò)低、中、高劑組ICAM-1、VCAM-1 mRNA及蛋白表達均顯著下降(P<0.01)；模型組核NF-κB蛋白表達明顯高于對照組(P<0.01)，與模型組比較，通心絡(luò)中、高劑組核NF-κB蛋白表達明顯降低(P<0.05)；總NF-κB mRNA及蛋白表達在各組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4，圖1、2。

表4 5組小鼠視網(wǎng)膜ICAM-1、VCAM-1和NF-κBmRNA及蛋白表達的變化

組別 ICAM-1mRNA蛋白VCAM-1mRNA蛋白總NF-κBmRNA蛋白核NF-κB對照組1.18±0.210.23±0.041.07±0.140.27±0.040.99±0.090.62±0.070.21±0.03模型組4.14±0.33*0.79±0.07*6.93±0.59*1.09±0.18*1.08±0.130.70±0.090.61±0.07*通心絡(luò)低劑組2.30±0.22△0.51±0.05△3.59±0.86△0.60±0.09△1.08±0.110.66±0.080.52±0.05通心絡(luò)中劑組2.68±0.29△0.49±0.07△2.61±0.39△0.51±0.07△1.12±0.080.69±0.090.43±0.05#通心絡(luò)高劑組2.64±0.51△0.44±0.04△1.80±0.26△0.42±0.06△1.09±0.190.64±0.070.34±0.04△

注：與對照組比較，*P<0.01；與模型組比較，#P<0.05，△P<0.01

圖1 4組熒光定量PCR擴增曲線

圖2 5組Western blot結(jié)果

3 討論

KK/Upj-Ay為自發(fā)性2型糖尿病小鼠，24周齡的KK/Upj-Ay小鼠能觀察到視網(wǎng)膜各層排列紊亂，出現(xiàn)空泡變性等明顯的糖尿病視網(wǎng)膜病變特征[5]。研究表明，通心絡(luò)膠囊灌胃3個月能明顯改善DR小鼠血液-視網(wǎng)膜屏障功能，表明通心絡(luò)膠囊對治療DR有一定的作用。在本實驗中，我們觀察到通心絡(luò)膠囊并沒有有效的控制血糖，說明通心絡(luò)對DR的作用是獨立于降糖作用之外的其他機制。

文獻報道了將正常和糖尿病視網(wǎng)膜病變的尸體眼進行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DR玻璃體內(nèi)ICAM-1、VCAM-1的含量顯著高于正常組(P<0.05)，并且與糖尿病類型及糖尿病病程無關(guān)[6]，在隨后的實驗研究中，也得到了一致的結(jié)論[7]。ICAM-1、VCAM-1是主要的黏附分子，同屬于免疫球蛋白超家族。我們觀察到KK/Upj-Ay血清中ICAM-1、VCAM-1含量顯著升高，視網(wǎng)膜中ICAM-1、VCAM-1表達亦顯著增高，提示了黏附分子在DR發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。通心絡(luò)膠囊能同時降低血清中的ICAM-1、VCAM-1含量和視網(wǎng)膜的表達，表明通心絡(luò)改善DR的作用與抑制粘附分子ICAM-1、VCAM-1密切相關(guān)。

NF-κB途徑是黏附分子參與DR的發(fā)病主要機制之一。高糖、缺氧等均能激活NF-κB，活化的NF-JB可上調(diào)黏附分子的表達，使白細(xì)胞淤滯、黏附于視網(wǎng)膜血管，引起一系列視網(wǎng)膜病變。我們結(jié)果顯示核NF-κB水平在DR小鼠中顯著升高，通心絡(luò)能抑制核NF-κB表達，表明通心絡(luò)抑制黏附分子的高表達是通過NF-κB途徑實現(xiàn)的。

隨著對黏附分子的深入研究，人們逐步認(rèn)識到黏附分子與DR關(guān)系密切。對其表達調(diào)控、信號途徑等做深入探討，對提高DR治療有重要臨床意義。對中藥在DR治療上黏附分子的研究，也將為DR治療提供重要的理論基礎(chǔ)。

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TheinhibitoryeffectofTongxinluocapsuleonadhesionmoleculesinmicewithdiabeticretinopathythroughinhibitingNF-κBpathway

WANGChao,XINGHanying,WANGXing,etal.DepartmentofGerontology,HebeiProvincialPeople’sHospital,Shijiazhuang050051,China

ObjectiveTo investigate the effect of Tongxinluo capsule on adhesion molecules in mice with diabetic retinopathy through inhibiting NF-κB pathway.MethodsKK/Upj-Ay mice were randomly divided into model group,Tongxinluo (low-dose,median-dose,high-dose) groups.C57BL/6 mice were selected as control group.The mice were given Tongxinluo intragastrically for 3 months.Then the retina barrier function was detected,and contents of ICAM-1,VCAM-1 were determined by flow cytometry.The expression levels of ICAM-1,VCAM-1 and NF-κB in retina were detected by Real Time PCR (qPCR) and Western Blot.ResultsThe contents of EB in Tongxinluo median-dose and high-dose groups were obviously decreased (P<0.01);the serum levels of ICAM-1 and VCAM-1in Tongxinluo median-dose and high-dose groups were significantly decreased (P<0.05);the expression levels of ICAM-1,VCAM-1 mRNA and protein in Tongxinluo groups were obviously decreased (P<0.01);expression levels of NF-κB in Tongxinluo median-dose and high-dose groups were obviously decreased (P<0.05),however,there were no significant differences in the expression levels of total NF-κB mRNA and protein among groups (P>0.05).ConclusionTongxinluo capsule can inhibit adhesion molecules in mice with diabetic retinopathy mice through inhibiting NF-κB pathway,as a result,which can improve diabetic retinopathy.

Tongxinluo capsule;diabetic retinopathy;adhesion molecules;NF-κB pathway

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.15.001

項目來源：國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)項目(編號：2012CB518606)

050051 石家莊市，河北省人民醫(yī)院老年醫(yī)學(xué)重點實驗室

R 587.2

A

1002-7386(2014)15-2245-03

2014-02-10)