潘志蘭 楊彥 張永梅 張志敏 馮麗倩 邢英杰

·論著·

急性髓系白血病患者CXXC5基因表達(dá)水平及與預(yù)后的相關(guān)性

潘志蘭 楊彥 張永梅 張志敏 馮麗倩 邢英杰

目的研究急性髓系白血病(AML)患者中CXXC5基因的表達(dá)水平，并分析其與臨床病理特征的相關(guān)性。方法應(yīng)用EvaGreen實時定量PCR( RQ-PCR) 方法檢測AML 患者中CXXC5基因表達(dá)量。結(jié)果結(jié)果顯示與24例對照相比，94 例AML患者CXXC5轉(zhuǎn)錄本水平顯著降低 (P<0.01)。44例(45.8%)AML 患者為CXXC5基因低表達(dá)，M1/M2/M3亞型患者CXXC5基因的低表達(dá)率顯著高于M4/M5/M6 亞型(P<0.01)。CXXC5基因低表達(dá)的 AML患者總體生存時間(OS)顯著長于非低表達(dá)者(P<0.01)。結(jié)論CXXC5低表達(dá)常見于AML患者中，且對AML預(yù)后具有良性影響。

白血病，髓系，急性；CXXC5；預(yù)后；實時定量PCR

急性髓系白血病(AML) 是一種造血系統(tǒng)的髓系原始細(xì)胞克隆性惡性增殖疾病，由造血干細(xì)胞/髓系祖細(xì)胞分化異常以及增生失控而引起[1,2]。該疾病的發(fā)生是一個多步驟事件，因多基因異常而使正常的造血干細(xì)胞喪失了自我更新能力和分化為多種成熟細(xì)胞系的能力，并同時轉(zhuǎn)化為白血病干細(xì)胞而累積在骨髓中[3,4]。研究證實，很多基因包括BAALC、ERG、MN1、EV11和WT1，都在AML中表達(dá)失調(diào)，并且和AML患者的療效和生存率都具有相關(guān)性[5,6]。CXXC5 (CXXC finger protein 5) 是最新鑒定的一種維甲酸敏感基因，它編碼維甲酸誘導(dǎo)的核因子(RINF)。通過基因表達(dá)研究和應(yīng)用基因沉默實驗表明，CXXC5在正常造血功能中發(fā)揮著非常重要的作用[7]。該基因定位于染色體5q31.2，它的染色體異常與各種髓系惡性腫瘤疾病均相關(guān)，包括低風(fēng)險5q突變的骨髓增生異常綜合征(MDS)[8]和高風(fēng)險5q缺失、5q突變的人類AML[9]。本實驗中，我們研究了CXXC5基因在AML患者骨髓中的表達(dá)水平，以及該基因的表達(dá)與患者臨床病理特征、預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 96例骨髓標(biāo)本均取自2011年1月至2014年1月期間在河北省石家莊市第一醫(yī)院血液科住院的初診AML患者,診斷及分類標(biāo)準(zhǔn)按《血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)》[10]?；颊吲R床病理學(xué)特征見表1。對照組骨髓標(biāo)本24例，其中包括19例缺鐵性貧血(IDA)和5例免疫性血小板減少癥患者。全部患者均于初診時抽取骨髓10 ml，肝素抗凝，用Ficoll密度梯度離心法分離單個核細(xì)胞。人類白血病細(xì)胞系(HL-60、NB4、THP-1、SHI-1、U937、HEL和K562)購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物所。細(xì)胞采用RPMI1640培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)于CO2培養(yǎng)箱(37℃、5% CO2)靜置培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好并且融合度達(dá)到80%左右時，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化進(jìn)行細(xì)胞傳代。

1.2 總RNA提取和cDNA合成 細(xì)胞計數(shù)后，按106個/ml在1.5 ml eppendorf管中加入適量TRIzol試劑，提取總RNA。分光光度法測定純度后取2.0 μg，應(yīng)用隨機引物逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA，總體系40 μl，含MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶200 U、dNTP(每種0.5 mmol/L)，10 mmol/L DTT，RNAsin 25 μl，37℃逆轉(zhuǎn)錄1 h，95℃ 5 min滅活，cDNA保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實時定量PCR(RQ-PCR) 應(yīng)用EvaGreen染料(Biotium，美國)在7300擴(kuò)增儀(ABI，美國)上完成RQ-PCR。CXXC5引物序列如下：上游引物，5’-GTGGACCCCTCGGCAGTTG-3’；下游引物，5’-CACACGAGCAGTGACATTGC-3’。PCR反應(yīng)體系包括：dNTP 0.2 mmol/L，MgCl24 mmol/L，引物0.4 μmol/L，1×ROX，1.0 U Taq DNA聚合酶(MBI，美國)，和50 ng cDNA。反應(yīng)條件：94℃變性30 s，62℃退火30 s，72℃延伸30 s，于84℃30 s記錄熒光量，共40循環(huán)，最后72℃延伸7 min。最終的溶解步驟按如下條件完成：95℃ 15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s，60℃ 15 s。采用蒸餾水代替cDNA作為無標(biāo)本對照(NTC)。標(biāo)準(zhǔn)率按如下公式計算：NCXXC5=(ECXXC5)ΔCT CXXC5(control-sample)÷(EGAPDH)ΔCT GAPDH(control-sample),其中，參數(shù)E公式：E=10(-1/slope)(斜率指CT與cDNA作圖所得)。我們選擇一例缺鐵性貧血患者的骨髓標(biāo)本，檢測得到的最小ΔCT(CXXC5和GAPDH)作為對照。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，Chi-square分析和Fisher法計算各組間差異。CXXC5基因表達(dá)水平和臨床病理特征相關(guān)性分析應(yīng)用Sperman檢測。Kaplan-Meier曲線和Cox regression用來分析CXXC5表達(dá)對生存率的影響，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXXC5基因在對照組中的表達(dá) CXXC5基因在所有對照組病例標(biāo)本中表達(dá)(0.17～1.00，0.49±0.19)。因此，將NCCXC5小于0.05(平均值±1.5標(biāo)準(zhǔn)差)設(shè)定為CXXC5基因在AML標(biāo)本中低表達(dá)的閾值。

2.2 CXXC5基因在人類白血病細(xì)胞系和AML患者中的表達(dá) 在7種人類白血病細(xì)胞系中，只有K526和THP-1中有CXXC5的表達(dá)，分別為2.84和0.31，其余的5種細(xì)胞系都表現(xiàn)為CXXC5的低表達(dá)(0.00～0.01)。與對照組相比，CXXC5在96例AML患者中的表達(dá)顯著下調(diào)(0.00～1.16，平均值0.07，P<0.001)。44例AML患者(45.8%)中CXXC5基因表達(dá)下調(diào)。見表1。

2.3 CXXC5基因表達(dá)與AML患者臨床病理特征的相關(guān)性 CXXC5基因表達(dá)與FAB分型具有相關(guān)性，與M4/M5/M6亞型比較(13.6%)，有更多的M1/M2/M3亞型患者中的CXXC5基因低表達(dá)(86.4%，P<0.01)。CXXC5基因低表達(dá)率在5/5qAML患者和其他核型患者組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。另外，CXXC5的低表達(dá)與患者性別、年齡、血常規(guī)指標(biāo)和細(xì)胞遺傳學(xué)風(fēng)險均無相關(guān)性(P>0.05)。見表1。

表1 CXXC5基因表達(dá)水平與AML患者臨床病理特征的相關(guān)性

2.4 CXXC5表達(dá)對患者預(yù)后的影響 我們對96例AML患者進(jìn)行了平均11個月的隨訪(1～72個月)。結(jié)果有15.4%(8/52) CCXC5高表達(dá)的患者生存，而CXXC5低表達(dá)的患者有45.5%(20/44)存活。經(jīng)統(tǒng)計分析，CXXC5低表達(dá)的AML患者的總生存期(OS)長于非低表達(dá)CXXC5的AML患者(P<0.01)。多變量分析顯示，CXXC5的表達(dá)水平、FAB亞型和細(xì)胞遺傳學(xué)風(fēng)險都是獨立的預(yù)后影響因素。見表2、圖1。

3 討論

CXXC5基因定位于染色體5q31.2，染色體區(qū)域缺失可能與AML疾病有關(guān)。我們進(jìn)行本實驗的目的就是為了探討該基因與AML的關(guān)系。研究表明，CCXC5基因在AML患者的人類白血病細(xì)胞中表達(dá)，但沒有發(fā)現(xiàn)突變的CCXC5基因編碼區(qū)，也沒有檢測到CCXC5 mRNA表達(dá)和FLT3-ITD或NPM1突變之間的關(guān)聯(lián)[10]。CCXC5基因在AML患者循環(huán)細(xì)胞中相對高水平表達(dá)，高CCXC5表達(dá)與不良預(yù)后和臨床化療敏感性相關(guān)。有人觀察了單核細(xì)胞分化和CCXC5基因表達(dá)之間的關(guān)聯(lián)，這類似于正常的造血功能中CXXC5表達(dá)也依賴于髓系細(xì)胞的分化狀態(tài)[11]。實驗中發(fā)現(xiàn)患者有低水平的不良細(xì)胞遺傳學(xué)異常，但考慮到非選擇性患者具有很高的中位數(shù)年齡，因此結(jié)果有待商榷。另外，研究中也沒能在任何患者中檢測到CXXC5基因的突變[11]。

表2 多變量分析影響AML患者總生存率的因素，HR，危險率(CI，可信區(qū)間)

圖1 CXXC5表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

有實驗研究了接受五種不同強化化療的初治AML患者人群中CXXC5基因表達(dá)和總生存期之間的關(guān)系，對于這些比較年輕的患者，總生存期主要體現(xiàn)在臨床化療敏感性，即原發(fā)性耐藥和AML復(fù)發(fā)的頻率[12]。高CXXC5表達(dá)水平和不良預(yù)后之間的關(guān)聯(lián)在下面患者中都可見：(1)未經(jīng)選擇的患者;(2)患者具有正常的細(xì)胞遺傳學(xué)特征；(3)基因異常是影響患者預(yù)后的核心因素。這些觀察結(jié)果都支持CXXC5高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)的假說,，而類似的高表達(dá)與不良預(yù)后相關(guān)的結(jié)果也在乳腺癌患者中被觀察到[13]。

實驗數(shù)據(jù)顯示CCXC5介導(dǎo)了抗凋亡作用，可以作為治療高危白血病的靶點。用典型AML細(xì)胞系，不成熟髓系白血病細(xì)胞K562來研究CXXC5表達(dá)對化療藥物敏感性的影響。實驗表明，CXXC5基因敲除后增加了化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的敏感性。這一結(jié)果提示，CXXC5表達(dá)是化療耐藥白血病細(xì)胞的表型。通過比較高和低CXXC5表達(dá)的患者AML細(xì)胞體外培養(yǎng)，兩個組表現(xiàn)出預(yù)期的自發(fā)性體外細(xì)胞凋亡。同時，在細(xì)胞培養(yǎng)液中加入目前用于白血病治療的藥物來那度胺[14]，它常用于治療5q-異常和低CXXC5表達(dá)MDS患者[15]。結(jié)果證明細(xì)胞的存活是由自發(fā)的體外凋亡連同藥物誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡共同發(fā)揮作用的。在低CXXC5表達(dá)組中，在體外培養(yǎng)過程中最大量的減少了AML細(xì)胞存活率是通過單獨應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡達(dá)到的；而在高CXXC5表達(dá)組中，凋亡是由自發(fā)誘發(fā)和藥物誘導(dǎo)聯(lián)合引起的。上述結(jié)果都支持CXXC5是細(xì)胞凋亡重要的調(diào)控基因這一假設(shè)。

其他實驗?zāi)Ｐ偷难芯恳脖砻?，藥理學(xué)抑制人白血病細(xì)胞抗凋亡的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)，可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡或增加化療的促凋亡效應(yīng)[16]，因此CXXC5/RINF的靶向治療可能是一種新的在人類白血病細(xì)胞中增加促凋亡活性和敏感性的策略。CXXC5/RINF沉默在AML細(xì)胞中的促凋亡活性的分子機制目前還不清楚。在神經(jīng)細(xì)胞和腎臟發(fā)育的實驗結(jié)果表明，WT1基因通過下調(diào)WNT-β-cathenin信號通路誘導(dǎo)CXXC5基因表達(dá)[17]。WT1和CXXC5/RINF表達(dá)之間的相關(guān)性可能表明，在原發(fā)性AML細(xì)胞中這兩個分子之間發(fā)生了串?dāng)_。然而，WNT-β-cathenin通路可以在AML細(xì)胞中組成性激活，這種激活似乎介導(dǎo)了抗凋亡作用[18]。因此，CXXC5在AML細(xì)胞中的抗凋亡作用可能不是通過WNT-β-cathenin途徑，而是通過其他機制激活促凋亡信號而發(fā)揮作用。RINF也表達(dá)于正常造血細(xì)胞，因此血液學(xué)毒性是抑制CXXC5治療AML的一種可能性。CXXC5在正常骨髓細(xì)胞中表達(dá)不排除考慮其用于治療白血病的可能性。一些患者尤其是高危患者表現(xiàn)為較高的白血病細(xì)胞水平，另外，生存能力不是由單一因素，而是由促或抗凋亡信號之間的平衡決定的。這種平衡決定了在正常和白血病細(xì)胞之間CXXC5基因抑制的后果。另外，結(jié)合不同的細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)途徑，包括CXXC5靶向同時結(jié)合血液毒性學(xué)是一種很有前途的治療癌癥策略。

本實驗中，我們檢測了AML患者骨髓中CXXC5的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CXXC5低表達(dá)常見于AML中，并且在幾種AML細(xì)胞中也有低表達(dá)。CXXC5的低表達(dá)是AML預(yù)后良好的一種預(yù)測指標(biāo)。但是，有關(guān)CXXC5在AML中的作用和機制都有待進(jìn)一步研究。

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CorrelationbetweentheexpressionlevelsofCXXC5geneandprognosisofpatientswithacutemyeloidleukemia

PANZhilan,YANGYan,ZHANGYongmei,etal.DepartmentofHematology,TheFirstHospitalofShijiazhuangCity,Shijiazhuang050011,China

ObjectiveTo investigate the expression levels of CXXC5 gene in patients with acute myeloid leukemia (AML),and to explore its correlation with clinical pathological characteristics.MethodsThe expression levels of CXXC5 in 96 patients with AML (AML group) and 19 cases of iron deficiency anemia as well as 5 cases of immune thrombocytopenia (control group) were detected by RQ-PCR.ResultsThe expression levels of CXXC5 gene in AML group were significantly decreased,as compared with those in control group (P<0.01).The low-expression of CXXC5 gene was found in 44 cases of AML (45.8%).The low-expression rate (86.4%) in AML patients with M1/M2/M3 subtype was significantly higher than that of AML patients with M4/M5/M6 subtype (13.6%,P<0.01).The overall survival (OS) time in AML patients with low-expression of CXXC5 was obviously longer than that of AML patients with non low-expression of CXXC5 (P<0.01).ConclusionThe low-expression of CXXC5 is a common and favorable event in patients with AML,which is favorable to prognosis of AML patients.

AML；CXXC5；prognosis；realtime quantitative PCR

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.15.004

050011 河北省石家莊市第一醫(yī)院血液內(nèi)科

R 733.712

A

1002-7386(2014)15-2253-04

2014-01-06)