吉 瑪,娘 洛,張淑云

(青海省果洛州班瑪縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,青海 果洛 814300)

豬肺炎支原體巢式PCR診斷方法的建立及應(yīng)用

吉 瑪,娘 洛,張淑云

(青海省果洛州班瑪縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,青海 果洛 814300)

為建立一種快速診斷豬肺炎支原體病原的方法，根據(jù)GenBank上登錄的Mhp基因組序列，在保守區(qū)基因內(nèi)部設(shè)計(jì)合成2對(duì)引物，經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測(cè)豬肺炎支原體的巢式PCR方法。結(jié)果表明，該方法對(duì)雞毒支原體、豬鼻支原體、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌、豬圓環(huán)病毒2型、豬偽狂犬病毒的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；第1次擴(kuò)增的敏感性是10 pg，第2次擴(kuò)增的敏感性是0.1 pg，第2次比第1次擴(kuò)增的敏感性高100倍。巢式PCR檢測(cè)方法具有特異性強(qiáng)、敏感性高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，可以在短時(shí)間內(nèi)準(zhǔn)確快速的檢測(cè)出低含量的Mhp病原，為豬肺炎支原體的快速診斷與凈化奠定基礎(chǔ)。

豬肺炎支原體；巢式PCR；診斷

豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneumoniae，Mhp)是引起豬支原體肺炎(MycoplasmaPneumoniaeofswine，MPS)俗稱豬氣喘病的主要致病原，感染豬常表現(xiàn)為豬呼吸道病綜合征(Porcine Respiratory Disease Complex，PRDC)[1]。豬氣喘病具有高度傳染性，雖死亡率不高，但發(fā)病率極高，感染豬主要表現(xiàn)為咳嗽并伴有呼吸困難、肺組織病變或大理石樣病變等臨床癥狀和病理變化[2-3]。該病可引起豬的生長(zhǎng)受阻，導(dǎo)致飼料轉(zhuǎn)化率大幅下降，豬生產(chǎn)性能降低。目前呈全球性流行與分布，其高發(fā)病率給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[4-7]。鑒于此，迫切需要加強(qiáng)對(duì)本病病原、流行病學(xué)、疫苗和診斷方法的深入研究，PCR診斷方法具有操作簡(jiǎn)單、特異性強(qiáng)、靈敏度高、可以檢測(cè)早期感染等優(yōu)點(diǎn)，為豬肺炎支原體的診斷提供了新的模式。張紅云等[8]和朱鳳瓊等[9]先后分別建立了檢測(cè)豬肺炎支原體的PCR方法，并進(jìn)行了臨床樣品的應(yīng)用檢測(cè)，取得較好的效果，但其靈敏度依然有限。巢式PCR是在常規(guī)PCR結(jié)束后，以第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，故其敏感性更高，適合對(duì)病毒含量很低時(shí)的樣品進(jìn)行鑒定。本研究將巢式PCR診斷技術(shù)應(yīng)用到Mhp的檢測(cè)中，建立了一種簡(jiǎn)單、快速、敏感、特異的Mhp巢式PCR分子生物學(xué)方法，從而實(shí)現(xiàn)Mhp的快速診斷與檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 菌株、毒株與載體 Mhp、雞毒支原體(MG)、豬鼻支原體(Mhr)、豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(App)、大腸桿菌DH5α和BL21(DE3)菌株、豬圓環(huán)病毒2型(PCV-2)、豬偽狂犬病毒(PRV)、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)均由青海省海西州動(dòng)物疫病控制中心實(shí)驗(yàn)室保存；克隆載體pMD18-T為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 Taq PCR 擴(kuò)增聚合酶、EcoRI與HindIII限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶為大連寶生物工程有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、病毒基因組RNA提取試劑盒、病毒基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒，購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA/RNA的提取 分別用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、病毒基因組DNA提取試劑盒提取Mhp、MG、Mhr、App、PCV-2、PRV的基因組DNA；用病毒基因組RNA提取試劑盒提取PRRSV RNA，并將其合成cDNA。所有DNA與cDNA均-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)已發(fā)表的Mhp基因組序列，選取P36基因保守區(qū)序列設(shè)計(jì)合成兩對(duì)特異性檢測(cè)引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primer

1.2.3 巢式PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 在保持其它反應(yīng)條件不變的前提下，分別以不同的模板用量(1、3、5、7、10 μL)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，確定最適的模板用量；在保持其它反應(yīng)條件不變的前提下，分別以不同的引物用量(0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 μL)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，確定最適的引物用量；在保持其它反應(yīng)條件不變的前提下，分別以不同的退火溫度(48 、50 、52 、54 、56 ℃)進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，確定最適的退火溫度。

1.2.4 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)與鑒定 取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳和凝膠成像掃描系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增片段的有無(wú)及大小的初步鑒定。將初步鑒定正確的特異性條帶用膠回收試劑盒回收，克隆至pMD18-T克隆載體，質(zhì)粒提取試劑盒抽提質(zhì)粒DNA，經(jīng)EcoRI/HindIII雙酶切鑒定，將正確的陽(yáng)性克隆質(zhì)粒送生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，以判斷PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的準(zhǔn)確性。

1.2.5 特異性檢測(cè) 分別以提取的豬Mhp、MG、Mhr、App、PCV-2、PRV的基因組DNA、PRRSV cDNA為模板，用已優(yōu)化確定的最佳條件進(jìn)行第一輪檢測(cè)。分別以第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，利用已優(yōu)化確定的最佳條件進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，確定巢式PCR檢測(cè)方法的特異性。

1.2.6 敏感性檢測(cè) 將提取的豬肺炎支原體基因組DNA依次適當(dāng)稀釋，使其含量分別為1 μg 、0.1 μg、10 pg、1 pg、0.1 pg、0.01 pg DNA，分別以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定巢式PCR檢測(cè)方法的敏感性。

1.2.7 重復(fù)性檢測(cè) 用本研究建立的巢式PCR檢測(cè)方法分別對(duì)MG、Mhr、App、PCV-2、PRV、PRRSV、3份Mhp陽(yáng)性病料和3份Mhp陰性病料重復(fù)檢測(cè)3次，確定巢式PCR檢測(cè)方法的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

1.2.8 臨床樣品應(yīng)用檢測(cè) 利用建立的Mhp巢式PCR診斷方法檢測(cè)臨床疑似Mhp感染的病料共計(jì)26份，以驗(yàn)證本巢式PCR診斷方法的臨床實(shí)用性。同時(shí)對(duì)部分陽(yáng)性PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行克隆和序列測(cè)定，以驗(yàn)證本診斷方法的準(zhǔn)確性和可靠性。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR最佳擴(kuò)增反應(yīng)的確定

根據(jù)PCR優(yōu)化試驗(yàn)確定最佳模板含量為0.1 μg，最佳引物含量為10 μmol，最佳退火溫度為58℃。確定第一輪PCR反應(yīng)體系為：5 μL 10×Taq Buffer、4 μL dNTP(2.5 mmol/L)、0.5 μL Taq、上下游引物P1、P2 (20 μmol/μL)各0.5 μL、DNA0.1 μg、加水至50 μL。確定第一輪PCR擴(kuò)增參數(shù)為：95 ℃ 4 min；94 ℃ 40s，52 ℃ 40s，72 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。確定第二輪RT-PCR反應(yīng)體系為：5 μL 10×Taq Buffer、4 μL dNTP(2.5 mmol/L)、0.5 μL Ex Taq、上下游引物P3、P4(20 μmol/μL) 各0.5 μL、模板(第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物)0.5 μL、加水至50 μL。確定第二輪PCR擴(kuò)增參數(shù)為：95 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。

2.2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)與鑒定

如圖1所示，第一輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在位于766 bp處、第二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在位于554 bp處均可見(jiàn)明顯的特異性DNA擴(kuò)增條帶，與試驗(yàn)設(shè)計(jì)預(yù)期大小相一致。如圖2所示，二輪PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別連接到PMD18-T克隆載體上構(gòu)建的克隆質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和HindIII雙酶切后分別得到預(yù)期的766 bp、554 bp的特異性條帶，與理論的設(shè)計(jì)相一致。生工生物工程(上海)股份有限公司的測(cè)序結(jié)果表明，插入到PMD18-T克隆載體中的基因片段核苷酸序列均為Mhp P36基因序列。表明PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為特異性Mhp序列，建立的豬肺炎支原體巢式PCR診斷方法具有極高的準(zhǔn)確性。

2.3 特異性檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果

如圖3、4所示，用建立的巢式PCR診斷方法檢測(cè)Mhp、MG、Mhr、App、PCV-2、PRV、PRRSV的結(jié)果顯示，第一輪和第二輪PCR都只能對(duì)豬肺炎支原體擴(kuò)增出大小與預(yù)期相符的特異性片段，而對(duì)其它菌、毒株均未擴(kuò)增出目的片段，表明該巢式PCR檢測(cè)方法具有良好的特異性。

圖1 PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 The products amplified with the two primersM.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000;1.第1輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物;2.第2輪擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物;3.4.空白對(duì)照M.DNA Marker DL 2000;1.The first round primer amplification product;2.The second round primer amplification product;3,4.Blank controls.

圖2 克隆載體的雙酶切鑒定Fig.2 Identification of cloning vectorM.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000;1.第1輪擴(kuò)增產(chǎn)物克隆載體的EcoRI and HindIII雙酶切;2.第2輪擴(kuò)增產(chǎn)物克隆載體的EcoRI and HindIII雙酶切M.DNA Marker DL 2000;1.The first round amplification product cloning into T vectors digested with EcoRI/HindIII;2.The second round amplification product cloning into T vectors digested with EcoRI/HindIII.

圖3 第一輪特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.3 The first round amplification specificity testM.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000;1.Mhp;2.MG;3.Mhr;4.App;5.PCV-2;6.PRV;7.PRRSV;8.對(duì)照M.DNA Marker DL 2000;1.Mhp;2.MG;3.Mhr;4.App;5.PCV-2;6.PRV;7.PRRSV;8.Control

圖4 第二輪特異性試驗(yàn)結(jié)果Fig.4 The second round amplification specificity testM.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2000;1.Mhp;2.MG;3.Mhr;4.App;5.PCV-2;6.PRV;7.PRRSV;8.對(duì)照M.DNA Marker DL 2000;1.Mhp;2.MG;3.Mhr;4.App;5.PCV-2;6.PRV;7.PRRSV;8.Control

2.4 敏感性檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果

如圖5、6所示，建立的巢式PCR診斷方法檢測(cè)不同梯度的模板含量顯示，第一輪PCR檢測(cè)的靈敏度可以達(dá)到10 pg DNA含量，而第二輪PCR檢測(cè)的靈敏度可以達(dá)到0.1 pg DNA含量，表明該巢式PCR檢測(cè)方法具有良好的敏感性。

圖5 第一輪擴(kuò)增的敏感性試驗(yàn)Fig.5 The first round amplification sensitive testM.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.1 μgDNA;2.0.1 μgDNA;3.10 pgDNA;4.1 pgDNA;5.0.1 pgDNA;6.0.01 pgDNA;7.對(duì)照M.DNA Marker DL 2 000;1.1 μgDNA;2.0.1 μgDNA;3.10 pgDNA ;4.1 pgDNA;5.0.1 pgDNA;6.0.01 pgDNA;7.Control

圖6 第二輪擴(kuò)增的敏感性試驗(yàn)Fig.6 The second round amplification sensitive testM.DNA標(biāo)準(zhǔn)DL 2 000;1.1 μgDNA;2.0.1 μgDNA;3.10 pgDNA;4.1 pgDNA;5.0.1 pgDNA;6.0.01 pgDNA;7.對(duì)照M.DNA Marker DL 2 000;1.1 μgDNA;2.0.1 μgDNA;3.10 pgDNA;4.1 pgDNA;5.0.1 pgDNA;6.0.01 pgDNA;7.Control

2.5 重復(fù)性檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果

用本研究建立的巢式PCR方法重復(fù)檢測(cè)MG、Mhr、App、PCV-2、PRV、PRRSV、3份Mhp陽(yáng)性病料和3份Mhp陰性病料，結(jié)果完全一致，巢式PCR檢測(cè)方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。

2.6 臨床應(yīng)用檢測(cè)試驗(yàn)結(jié)果

利用建立的Mhp巢式PCR診斷方法共檢測(cè)了26份臨床疑似Mhp感染的病料，檢出陽(yáng)性病料樣品15份，隨機(jī)選取10份陽(yáng)性樣品PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆與序列測(cè)定，結(jié)果顯示10份陽(yáng)性產(chǎn)物均為Mhp，表明建立的Mhp巢式PCR診斷方法能夠準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)Mhp感染，具有良好的臨床實(shí)用價(jià)值。

3 討 論

鑒于Mhp對(duì)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的極大危害，因此需加強(qiáng)對(duì)該病原的快速、準(zhǔn)確診斷。由于Mhp的生長(zhǎng)條件十分苛刻，在一般培養(yǎng)基中較難生長(zhǎng)，且培養(yǎng)耗時(shí)較長(zhǎng)、培養(yǎng)菌液的滴度較低[10]，通常情況下分離培養(yǎng)診斷并不可行，所以細(xì)菌的分離培養(yǎng)與鑒定方法不適合本病的快速診斷。PCR技術(shù)可以特異性的檢測(cè)菌種的核酸，具有極高的準(zhǔn)確性，且PCR方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、可以檢測(cè)早期感染，具有常規(guī)診斷方法無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。P36基因?yàn)橐环N乳酸脫氫酶蛋白(LDH)，具有種族特異性的抗原決定區(qū)域，可以誘導(dǎo)早期免疫反應(yīng)，且P36基因在Mhp進(jìn)化過(guò)程中高度保守，具有高度保守性，適合用于對(duì)Mhp的診斷與檢測(cè)[11-12]。劉茂軍等[8]和張紅云等[13]根據(jù)P36基因的核苷酸序列建立了檢測(cè)Mhp的常規(guī)PCR方法，但敏感性有限。巢式PCR在PCR基礎(chǔ)上建立的，敏感性更高，特異性更強(qiáng)。當(dāng)送檢樣品含量很低時(shí)也可以特異檢出病原。

本研究根據(jù)GenBank上登錄的Mhp基因組P36基因序列，設(shè)計(jì)合成2對(duì)引物，經(jīng)過(guò)PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測(cè)Mhp的巢式PCR方法。該檢測(cè)對(duì)MG、Mhr、App、PCV-2、PRV的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；該方法第1次擴(kuò)增的敏感性是10 pg，第2次擴(kuò)增的敏感性是0.1 pg，第2次比第1次擴(kuò)增的敏感性高100倍；該方法重復(fù)檢測(cè)MG、Mhr、App、PCV-2、PRV、PRRSV、3份豬肺炎支原體陽(yáng)性病料和3份豬肺炎支原體陰性病料的結(jié)果完全一致。因巢式PCR方法的敏感性要比普通PCR方法高很多，其敏感性可與熒光定量PCR方法相當(dāng)，但所用儀器與試劑只是普通的PCR儀器與試劑，不需要熒光定量PCR方法要求的特殊儀器設(shè)備與試劑。由于巢式PCR方法極高的敏感性，故在試驗(yàn)過(guò)程中容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，應(yīng)特別注意避免污染問(wèn)題，并設(shè)立陰性對(duì)照加以控制。本研究建立的Mhp巢式PCR診斷方法具有良好的準(zhǔn)確性、特異性、敏感性、重復(fù)性、穩(wěn)定性和臨床實(shí)用性，可以在短時(shí)間內(nèi)快速的檢測(cè)出低含量的Mhp，為本病的快速檢測(cè)及早期發(fā)現(xiàn)和治療奠定了基礎(chǔ)。

[1]Nathues H,Woeste H,Doehring S,et al.Detection of Mycoplasma hyopneumoniae in nasal swabs sampled from pig farmers[J].Vet Rec,2012,170(24):623.

[2]Potter M L,Kane E M,Bergstrom J R,et al.Effects of diet source and vaccination for porcine circovirustype 2 and Mycoplasma hyopneumoniae on nursery pig performance[J].J Anim Sci,2012,90(11):4 063-4 071.

[3]張 悅,劉茂軍,邵國(guó)青.豬肺炎支原體主要抗原蛋白的研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào),2013,29(2):16-22.

[4]Savic B,Ivetic V,Milicevic V,et al.Genetic diversity of Mycoplasma hyopneumoniae isolates from conventional farrow-to-finish pig farms in Serbia[J].Acta Vet Hung,2010,58(3):297-308.

[5]Halli O,Ala-Kurikka E,Nokireki T,et al.Prevalence of and risk factors associated with viral and bacterial pathogens in farmed European wild boar[J].Vet J,2012,194(1):98-101.

[6]Kukushkin S,Okovytaya T.Seroprevalence of Lawsonia intracellularis,Mycoplasma hyopneumoniae and PCV2 in commercial pig farms in Russia[J].Vet Rec,2012,171(5):126.

[7]王娟萍,姚敬明,吳 忻,等.3種豬肺炎支原體疫苗對(duì)仔豬的免疫試驗(yàn)[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2012,48(5):45-46.

[8]張紅云,梁晶晶,李回,等.豬肺炎支原體PCR檢測(cè)方法的建立及初步臨床應(yīng)用[J].廣西農(nóng)業(yè)科學(xué),2010,41(3): 256-257.

[9]朱鳳瓊,陳達(dá)燕,楊林富,等.豬肺炎支原體PCR檢測(cè)方法的建立研究[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技,2012,(03):319-321.

[10]韋艷娜,白昀,孔猛,等.豬肺炎支原體的分離方法[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2012,28(1): 104-107.

[11]Caron J,Ouardani M,Dea S.Diagnosis and differentiation of Mycoplasma hyopneumoniae and Mycoplasma hyorhinis infections in pigs by PCR amplification of the p36 and p46 genes[J].J Clin Microbiol,2000,38(4):1 390-1 396.

[12]Zou H Y,Liu X J,Ma F Y,et al.Attenuated Actinobacillus pleuropneumoniae as a bacterial vector for expression of Mycoplasma hyopneumoniae P36 gene[J].J Gene Med,2011,13(4):221-229.

[13]劉茂軍,李冬梅,邵國(guó)青,等.豬肺炎支原體PCR鑒定方法的建立[J].金陵科技學(xué)院學(xué)報(bào),2008,24(3): 99-101.

EstablishmentandApplicationofMycoplasmahyopneumoniaeNestedPCRDiagnosisMethod

JI Ma,NIANG Luo,ZHANG Shu-yun

(AnimalDiseaseControlCenter,GuoluoBanmaCountyofQinghaiProvince,Guoluo,Qinghai814300,China)

In order to establish a rapid mycoplasma pneumonia pathogen detection method,the study designed two pairs of primers in internal conserved gene based on Mhp genome sequence in GenBank.after optimization of PCR reaction conditions,a nested PCR method for Mhp detection was established.The results showed that the method appeared negative for M.gallisepticum,M.hyorhinis,APP,PCV2,PRV the amplification result;the first amplification sensitivity of this method was 10pg,the second amplification sensitivity 0.1 pg;the second amplification was 100 times more sensitive than the first amplification.The nested PCR method has the advantages of high specificity,high sensitivity,good reproducibility;it can detect low content of Mhp pathogen in a short period of time,which lays a foundation for rapid diagnosis and purification of Mycoplasma pneumoniae.

Mycoplasmahyopneumoniae;nested PCR;diagnosis;application

2013-05-17，

2013-06-09 [作者簡(jiǎn)介]吉 瑪(1974-),女,藏族，青海樂(lè)都人，本科，獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物防疫工作。E-mail: jima1974@126.com

S811.6

A

1005-5228(2014)2-0053-05