周姍姍+徐金娣+沈紅+劉歡歡+李松林

[摘要] 該研究建立了UPLC-Q-TOF-MS/MS結(jié)合自制對(duì)照藥材的硫磺熏蒸人參快速篩查方法。采用道地藥材通過常規(guī)程序制備硫磺熏蒸人參對(duì)照藥材，應(yīng)用UPLC-Q-TOF-MS/MS發(fā)現(xiàn)和鑒定硫磺熏蒸人參對(duì)照藥材8個(gè)特征成分，選擇質(zhì)譜響應(yīng)較高的25-hydroxyl-Re sulfate作為標(biāo)志物，研究其質(zhì)譜裂解，選取豐度較高的特征離子m/z 879.44作為提取離子，再通過優(yōu)化質(zhì)譜條件提高特征離子m/z 879.44質(zhì)譜響應(yīng)值，提高篩查方法靈敏度。應(yīng)用所建立的方法篩查了來源于不同地區(qū)的21份商品生曬參，有9份樣品化學(xué)輪廓與硫磺熏蒸人參對(duì)照藥材相似，且都檢測(cè)到25-hydroxyl-Re sulfate的特征離子m/z 879.44，表明近43%商品生曬參是硫磺熏蒸品。同時(shí)采用2010年版《中國藥典》附錄方法測(cè)定21批藥材中二氧化硫殘留，結(jié)果一致。與二氧化硫殘留檢測(cè)方法相比，該方法選擇性更強(qiáng)、更快速，可為人參質(zhì)量控制提供有效輔助手段。

[關(guān)鍵詞] UPLC-Q-TOF-MS/MS；人參；硫磺熏蒸

[收稿日期] 2014-03-14

[基金項(xiàng)目] 國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81202920， 81303221， 81373946）；國家中醫(yī)藥管理局行業(yè)專項(xiàng)（201307008-2）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃（863）項(xiàng)目（2014AA022204）

[通信作者] 李松林，Tel：（025） 85639640，E-mail： songlinli64@126.com

[作者簡介] 周姍姍，碩士研究生，Tel： 15005169280，E-mail： shanshan9280@126.com

人參Ginseng Radix et Rhizoma是常用中藥材[1]，人參皂苷是其主要生物活性成分[1-2]。生曬參初加工過程中常用硫磺熏蒸增白防霉[3]。文獻(xiàn)報(bào)道硫磺熏蒸人參的免疫調(diào)節(jié)作用明顯下降[4]，但至今未見硫磺熏蒸人參快速篩查方法的報(bào)道。

前期研究發(fā)現(xiàn)人參經(jīng)硫磺熏蒸后其中的部分人參皂苷會(huì)轉(zhuǎn)化成人參皂苷含硫衍生物[3，5]。這些人參皂苷含硫衍生物是硫磺熏蒸人參的特征性成分，是區(qū)分硫磺熏蒸與未硫磺熏蒸人參潛在的標(biāo)志物。然而，這種人參皂苷含硫衍生物制備成本高，至今未見商品化學(xué)對(duì)照品銷售。對(duì)于化學(xué)對(duì)照品難以獲得的中藥材，使用對(duì)照藥材進(jìn)行對(duì)照鑒定是當(dāng)前中藥材質(zhì)量控制常用的輔助方法[6]。

超高效液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技術(shù)將高分離效能和強(qiáng)大的結(jié)構(gòu)鑒定功能結(jié)合起來，為中藥材化學(xué)成分的快速表征提供了簡便、準(zhǔn)確的手段，已廣泛用于藥材的質(zhì)量控制研究[7-8]。本研究建立了UPLC-Q-TOF-MS/MS結(jié)合自制對(duì)照藥材快速篩查硫磺熏蒸人參的方法，并對(duì)2013年不同地區(qū)隨機(jī)抽樣商品生曬參進(jìn)行快速篩查品質(zhì)評(píng)價(jià)，同時(shí)應(yīng)用2010年版《中國藥典》附錄二氧化硫殘留量檢測(cè)方法進(jìn)行了驗(yàn)證，為人參質(zhì)量控制方法和相關(guān)監(jiān)管法規(guī)的制定提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 Waters 超高效液相色譜儀配二極管陣列檢測(cè)器，聯(lián)接SYNAPT G2-S 四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（Waters，美國公司）；METTLER 1/10萬電子天平（瑞士）；Milli-Q型純水器（美國Millipore公司）；KQ-250E型超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司） ；磁力攪拌器（金壇市富化儀器有限公司）；二氧化硫殘留測(cè)定裝置（青島仁和興實(shí)驗(yàn)科技有限公司），酸式滴定管（50 mL），碘滴定液（0.01 mol·L^-1），淀粉指示液。甲醇、甲酸、乙腈為色譜純，水為超純水，其他試劑為分析純。

1.2 藥材 人參對(duì)口藥材（JSPACM-03-65，G0）采自吉林通化（五年生，2012年11月），21批商品人參（G1～G21）為2013年4月購自不同城市，見表1，經(jīng)江蘇省中醫(yī)藥研究院李松林研究員依據(jù)《中國藥典》鑒定為五加科植物人參P. ginseng的干燥根和根莖。藥材標(biāo)本現(xiàn)保存于江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥分析和代謝組研究室。

1.3 硫磺熏蒸人參對(duì)照藥材的制備 硫磺熏蒸人參樣品由本實(shí)驗(yàn)室自制，硫磺熏蒸程序模擬藥農(nóng)或批發(fā)商硫磺熏蒸藥材過程。100 g非硫磺熏蒸人參片（JSPACM-03-65，G0），用10 mL水濕潤，放置0.5 h。將點(diǎn)燃的10 g硫磺粉末和潤濕的人參片分別放入有隔層密閉容器的下層和上層，保持硫磺充分燃燒。容器密閉12 h，取出硫磺熏蒸后人參藥材于40 ℃干燥12 h，重復(fù)制備3份，得硫磺熏蒸人參對(duì)照藥材（G0-1～G0-3）。

1.4 供試品溶液制備 精密稱取人參藥材粉末（G0～G21） 0.2 g，置具塞試管中，加70%甲醇10 mL，室溫超聲提取1 h，濾過，過0.22 μm微孔濾膜，即得。

1.5 色譜條件 Waters ACQUITY HSS T3色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；流動(dòng)相A-0.1% 甲酸水， B-含0.1%甲酸的乙腈； 梯度洗脫： 5% B（0～1 min）， 5%～35% B（1～5 min）， 35%～42% B（5～7 min）， 42%～80% B（7～8 min）， 80%～95% B（8～9 min）， 95%～5% B（9～9.5 min）， 5% B（9.5～10 min）；流速0.4 mL·min^-1；柱溫箱和自動(dòng)進(jìn)樣器溫度分別為35， 10 ℃；進(jìn)樣量1 μL。

1.6 質(zhì)譜條件 Waters SYNAPT G2-S Q-TOF 質(zhì)量分析器（Waters MS Technologies，Manchester，UK）；電噴霧離子源，采用負(fù)離子模式掃描；Q-TOF采集率0.2 s；碰撞能量40～50 eV；毛細(xì)管電壓2 500 V；錐孔電壓30 V；離子源溫度100 ℃；去溶劑化溫度450 ℃，流速800 L·h^-1；錐孔氣流速50 L·h^-1；質(zhì)量掃描范圍m/z 50～1 500。endprint

1.7 二氧化硫殘留量測(cè)定 按2010年版《中國藥典》一部附錄IX U進(jìn)行[1]。精密稱取人參藥材粉末10 g，置兩頸圓底燒瓶中，加水400 mL。錐形瓶內(nèi)加入水125 mL和淀粉指示液1 mL作為吸收液，置于磁力攪拌器上不斷攪拌。往燒瓶底部通入氮?dú)?，并調(diào)節(jié)適宜的氣體流量。打開帶刻度分液漏斗的活塞，使6 mol·L^-1鹽酸溶液10 mL流入燒瓶中。給兩頸燒瓶內(nèi)的溶液加熱至沸，并保持微沸約3 min后開始用碘滴定液（0.01 mol·L^-1）滴定，吸收液置于磁力攪拌器上不斷攪拌，至吸收液顯藍(lán)色或藍(lán)紫色持續(xù)30 s不完全消褪。每1 mL的碘滴定液（0.01 mol·L^-1） 相當(dāng)于0.640 6 mg的SO₂。

2 結(jié)果

2.1 非硫磺熏蒸人參與硫磺熏蒸對(duì)照藥材特征標(biāo)志物的確認(rèn) 采用所建立的UPLC-Q-TOF-MS/MS方法快速分析非硫磺熏蒸人參對(duì)口藥材和硫磺熏蒸人參對(duì)照藥材樣品，樣品BPI色譜圖見圖1。從圖1中可發(fā)現(xiàn)硫磺熏蒸人參對(duì)照藥材的化學(xué)輪廓明顯不同于非硫磺熏蒸人參對(duì)口藥材。色譜峰1～8只在硫磺熏蒸人參對(duì)照藥材樣品中檢測(cè)到，表明硫磺熏蒸可以導(dǎo)致人參中的化學(xué)成分發(fā)生轉(zhuǎn)化，產(chǎn)生了新的成分，從而改變藥材的化學(xué)輪廓。通過比較發(fā)現(xiàn)3批硫磺熏蒸人參對(duì)照藥材樣品G0-1～G0-3的化學(xué)輪廓高度相似，證明該硫磺熏蒸方法重復(fù)性和穩(wěn)定性都較好。因此，本研究選用該法制備的硫磺熏蒸人參作為對(duì)照藥材，峰1～8作為硫磺熏蒸人參的特征標(biāo)志物。

2.2 特征標(biāo)志物的鑒定 根據(jù)色譜峰1～8在負(fù)離子模式下的保留時(shí)間、精確分子量及碎片信息，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)這些色譜峰進(jìn)行結(jié)構(gòu)解析，初步鑒定均為人參皂苷的含硫衍生物，見表2。

2.3 篩查用標(biāo)志物特征離子的選擇和質(zhì)譜條件優(yōu)化 圖1-B，C，D中，色譜峰2顯示了較高的質(zhì)譜響應(yīng)值，因此選擇峰2代表的化合物（25-hydroxyl-Re sulfate）作為篩查標(biāo)志物，見圖2，分別考察了質(zhì)譜碰撞能量和錐孔電壓對(duì)該標(biāo)志物質(zhì)譜裂解的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)選擇碰撞能量為40～50 eV時(shí)，具有更豐富的碎片離子，見圖2，3。但錐孔電壓為30 V時(shí)，碎片離子m/z 879.44[M-H-Rha]^-豐度最強(qiáng)，見圖4。因此，選擇碰撞能量和錐孔電壓分別為40～50 eV和30 V，以特征碎片離子m/z 879.44作為提取離子進(jìn)行硫磺熏蒸人參的篩查。

2.4 商品生曬參篩查 采用已建立的UPLC-Q-TOF-MS/MS方法分析了2013年分別購買于上海、吉林、北京、廣州和南京的21批商品生曬參藥材，發(fā)現(xiàn)這21批商品人參藥材有9批藥材與G0-1（或G0-2，或G0-3）的化學(xué)輪廓圖一致，見圖5。采用提取離子（extracting ion）模式在這9批藥材色譜圖中相同的保留時(shí)間均提取到特征離子m/z 879.44，表明這9批商品生曬參都是硫磺熏蒸品。另外12批生曬參商品藥材與G0的化學(xué)輪廓圖基本一致，也未提取到特征離子m/z 879.44，見表1，提示這些商品生曬參未經(jīng)硫磺熏蒸。

2.5 二氧化硫殘留量測(cè)定結(jié)果 人參藥材中二氧化硫殘留量檢測(cè)結(jié)果見表1。由表1可知，自制硫熏人參對(duì)照藥材和9批商品人參藥材中檢測(cè)到二氧化硫殘留，其余12批商品人參藥材及對(duì)口藥材均未檢測(cè)到二氧化硫殘留，與上述UPLC-Q-TOF-MS/MS方法篩查結(jié)果一致，進(jìn)一步證明9批商品人參是硫磺熏蒸品。

3 討論

硫磺熏蒸由于其成本低、操作方便和兼有漂白的功效，當(dāng)前被廣泛應(yīng)用于中藥材的初加工，對(duì)包括生曬參在內(nèi)藥材的儲(chǔ)運(yùn)防蟲、防霉起到一定的作用[10]。然而，研究表明硫磺熏蒸不但可導(dǎo)致藥材有害二氧化硫和重金屬殘留，而且使部分藥材或其提取物中原有活性組分發(fā)生化學(xué)轉(zhuǎn)化[11-12]，存在藥效改變甚至安全隱患[13-15]。2004年國家監(jiān)管部門出臺(tái)文件，將硫磺熏蒸藥材作為劣藥論處。2008年版《中國藥典》增補(bǔ)本通過檢測(cè)二氧化硫殘留量來篩查硫磺熏蒸中藥材。然而，二氧化硫易揮發(fā)，在藥材加工、炮制或貯藏過程中含量可能會(huì)降低。顯然，僅通過檢測(cè)二氧化硫殘留量可能會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。另外，現(xiàn)有二氧化硫殘留量檢測(cè)方法每個(gè)樣品耗時(shí)可能在半小時(shí)至數(shù)小時(shí)。因此，建立快速和高選擇性的篩查硫磺熏蒸中藥材的方法顯得尤為迫切。

本研究建立了一種硫磺熏蒸人參的高選擇性、快速篩查方法。采用自制對(duì)照藥材可以彌補(bǔ)無特征化學(xué)對(duì)照品的不足，同時(shí)可降低檢測(cè)成本。與二氧化硫殘留檢測(cè)方法相比，本方法采用UPLC-Q-TOF-MS/MS鑒定硫熏人參對(duì)照藥材的特征標(biāo)志物，并選擇和優(yōu)化篩查提取用特征離子，提高了方法的選擇性。樣品分析操作可以在10 min內(nèi)完成，大大提高了樣品篩查速度，為人參質(zhì)量控制提供了有效的輔助手段。

用所建立的方法對(duì)2013年購買的商品生曬參篩查發(fā)現(xiàn)，近43%的商品生曬參是硫磺熏蒸品，采用2010年版《中國藥典》一部附錄二氧化硫殘留量檢測(cè)方法檢測(cè)，結(jié)果一致，提示商品生曬參硫磺熏蒸仍然嚴(yán)重。9批硫熏商品二氧化硫殘留量在12.8～339.5 mg·kg^-1，特別是有4批殘留量大于150 mg·kg^-1，超過了2010年版《中國藥典》增補(bǔ)標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)規(guī)定（不超過150 mg·kg^-1）。因此，在硫磺熏蒸人參化學(xué)成分發(fā)生轉(zhuǎn)化，但其有效性和安全性沒有系統(tǒng)驗(yàn)證的情況下，必須對(duì)硫磺熏蒸人參進(jìn)行篩查，確保商品生曬參的質(zhì)量，從而保證其臨床應(yīng)用的有效和安全。當(dāng)然，硫磺熏蒸對(duì)人參的有效性和安全性有何影響，亦或如何規(guī)范硫磺熏蒸工藝，在達(dá)到防蟲、防霉的同時(shí)又能保證其安全和有效，仍然是迫切需要深入研究的課題。

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Development of UPLC-Q-TOF-MS/MS combined with reference herbendprint

approach to rapidly screen commercial sulfur-fumigated ginseng

ZHOU Shan-shan， XU Jin-di， SHEN Hong， LIU Huan-huan， LI Song-lin

（1. Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210046， China；

2. Department of Pharmaceutical Analysis and Metabolomics， Jiangsu Province Academy of

Traditional Chinese Medicine and Jiangsu Branch of China Academy of Chinese Medical Sciences， Nanjing 210028， China）

[Abstract] An ultra-performance liquid chromatography-quadrupole/time of flight mass spectrometry（UPLC-Q-TOF-MS/MS） combined with reference herb method was developed to rapidly screen commercial sulfur-fumigated ginseng. Sulfur-fumigated ginseng reference herb was prepared using genuine ginseng by conventional procedure. Then the reference sulfur-fumigated ginseng sample was analyzed by UPLC-Q-TOF-MS/MS to identify characteristic marker components. 25-hydroxyl-Re sulfate with higher abundance was selected as marker compound from 8 characteristic components identified in sulfur-fumigated ginseng reference herb. The fragmentation of 25-hydroxyl-Re sulfate was extensively investigated， fragment ion m/z 879.44 with higher intensity was chosen as the characteristic ion of sulfur-fumigated ginseng. The response of ion m/z 879.44 was improved by optimizing the MS conditions so that this ion could be used as the characteristic marker ion for screening purpose in ion extracting screening mode. The established approach was successfully applied to inspect 21 commercial ginseng samples collected from different cities in China. It was found that the chemical profiles of 9 samples were similar to that of sulfur-fumigated ginseng reference herb， and the characteristic ion m/z 879.44 of 25-hydroxyl-Re sulfate was also detected in these samples， suggesting that there were nearly 43% ginseng samples analyzed being sulfur-fumigated. This finding agreed well with the results of sulfur dioxide residues of these 21 commercial ginseng samples determined with the method documented in Chinese Pharmacopeia. Compared with the method documented in Chinese Pharmacopeia， the proposed approach is more rapid and specific for screening sulfur-fumigated ginseng. SFDA of China should strengthen the enforcement to prohibit ginseng being sulfur-fumigated， so that ginseng and it preparations could be effectively and safely benefit to the health of human beings.

[Key words] UPLC-Q-TOF-MS/MS； ginseng； sulfur fumigation

doi：10.4268/cjcmm20141504

[責(zé)任編輯 孔晶晶]endprint