寧子琬+毛春芹+陸兔林+季德+劉靜+季琳+楊歡+王法琴

[摘要] 比較不同加工方法對天麻中有效成分含量及SO₂殘留量的影響。采用HPLC測定天麻中5種有效成分的含量，Merck Purospher STAR色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；甲醇（A）-0.1%甲酸水（B）為流動相，梯度洗脫；流速 1 mL·min^-1；柱溫為35 ℃；檢測波長為270 nm；進樣量為10 μL。在上述色譜條件下，5種成分均得到很好的分離，各成分的質(zhì)量濃度與峰面積之間線性關(guān)系良好（r ≥0.999 8），平均回收率為98.38% ～ 102.5%（RSD≤1.7%）。天麻藥材經(jīng)煮制、硫磺熏蒸后，腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森苷的含量與蒸制所得天麻藥材相比均有不同程度的降低；且經(jīng)硫磺熏蒸后的天麻藥材二氧化硫殘留量均超過400 mg·kg^-1，此為制定天麻藥材加工干燥的質(zhì)量標準提供了科學(xué)依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 天麻； 蒸煮工藝； 硫磺熏蒸； HPLC； 有效成分

[收稿日期] 2014-03-09

[基金項目] 科技部行業(yè)專項（201307008）

[通信作者] 陸兔林，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥炮制及中藥質(zhì)量標準研究，Tel：13951636763，E-mail： lutuling2005@126.com

[作者簡介] 寧子琬，碩士研究生， Tel：18252067573，E-mail：ningziwan1990@126.com

天麻Gastrodiae Rhizoma，原名赤箭，是我國傳統(tǒng)的名貴中藥。甘，平。歸肝經(jīng)。息風(fēng)止痙，平抑肝陽，祛風(fēng)通絡(luò)。用于小兒驚風(fēng)，癲癇抽搐，破傷風(fēng)，頭痛眩暈，手足不遂，肢體麻木，風(fēng)濕痹痛[1]。天麻含有大量水分、多糖、黏液質(zhì)，不易于干燥。通過調(diào)研及文獻研究發(fā)現(xiàn)，基層藥廠及藥農(nóng)在前期蒸制天麻新鮮藥材時，為節(jié)約成本仍采用煮法。此外，為了防止其發(fā)霉及使其外型美觀對其進行硫磺熏蒸，且此現(xiàn)象較為嚴重。本課題通過蒸煮工藝比較，不同程度、不同熏蒸次數(shù)比較，研究不同加工方法對天麻有效成分及SO₂殘留量的影響。2010年版《中國藥典》（一部）天麻含量測定項下，僅對天麻素做了相關(guān)規(guī)定。查閱相關(guān)文獻，發(fā)現(xiàn)天麻素及其苷元通常被認為是天麻的活性成分[2]，其具有鎮(zhèn)痛、降壓、解痙等藥理作用[3-4]。王莉等[5]研究發(fā)現(xiàn)腺苷及巴利森苷與天麻的藥效作用相吻合。本研究以腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森苷5種成分為指標，對不同加工方法的天麻藥材進行了含量分析及SO₂殘留量的測定，更加客觀、全面的評價了不同加工方法對天麻質(zhì)量的影響。

1 材料

Waters 2695 高效液相色譜儀（Waters 2998 檢測器），Empower色譜工作站；Milli-Q Intergral水純化系統(tǒng)（美國Millipore公司）；FA1104型電子分析天平（1/1萬，上海精密科學(xué)儀器有限公司）；MS105DU型電子分析天平（1/10萬，梅特勒-托利多公司）；HH-S型水浴鍋（鞏義市英峪予華儀器廠）；DHG-9140A型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）。

腺苷對照品（批號20130407，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），天麻素對照品（批號110807-200205，中國食品藥品檢定研究院），對羥基苯甲醇對照品（批號20130502，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），對羥基苯甲醛對照品（批號20120903，國藥集團化學(xué)試劑有限公司），巴利森苷對照品（批號ZJ0628BA13，上海源葉生物科技有限公司），甲醇（色譜純，山東禹王實業(yè)有限公司化工分公司），甲酸（分析純，南京試劑廠），Milli-Q超純水。

天麻新鮮藥材（仿野生栽培品種）采自陜西省略陽縣，采樣時間2013-11-20。經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院陸兔林教授鑒定為蘭科植物天麻Castrodia elata BL. 的新鮮藥材。

2 方法與結(jié)果

2.1 對中藥材天麻進行蒸煮工藝、不同程度、不同熏蒸次數(shù)的比較性研究

2.1.1 蒸、煮樣品的制備 蒸法組：將采收后的新鮮天麻，水洗除棄泥土，平行3份，放于蒸籠中蒸至斷面無白心， 55 ℃熱風(fēng)干燥至五六成干時取出，發(fā)汗，壓扁，繼續(xù)烘至麻體變硬，取出。

煮法組：將采收后的新鮮天麻，水洗除棄泥土，平行3份，放于鍋中煮至斷面無白心，至五六成干時取出，發(fā)汗，壓扁，繼續(xù)烘至麻體變硬，取出。

2.1.2 不同干燥程度硫磺熏蒸樣品的制備 模擬產(chǎn)地硫磺熏蒸過程，即將天麻放置在金屬箱內(nèi)，在箱底瓷盤內(nèi)點燃適量硫磺，上覆箱蓋，開小口，開始計時，熏蒸6 h后，取出。

直接熏蒸組：天麻藥材經(jīng)蒸制后用硫磺熏蒸一次，繼而55 ℃熱風(fēng)干燥至麻體變硬，取出。具體硫磺熏蒸操作步驟如上描述，平行3份。

五成干熏蒸組：天麻藥材經(jīng)蒸制后，在55 ℃熱風(fēng)干燥至五成干時，用硫磺熏蒸1次，取出，繼續(xù)用熱風(fēng)干燥至麻體變硬。具體硫磺熏蒸操作步驟如上描述，平行3份。

八成干熏蒸組：天麻藥材蒸制后，在55 ℃熱風(fēng)干燥至八成干時，用硫磺熏蒸1次，取出，繼續(xù)用熱風(fēng)干燥至麻體變硬。具體操硫磺熏蒸作步驟如上描述，平行3份。

2.1.3 不同硫磺熏蒸次數(shù)樣品的制備 熏蒸2次組：將天麻藥材在蒸制后、五成干時各用硫磺熏蒸1次，取出，55 ℃熱風(fēng)干燥至麻體變硬。具體操作步驟如上描述，平行3份。

熏蒸3次組：將天麻藥材在蒸制后、五成干、八成干時各用硫磺熏蒸1次，取出，55 ℃熱風(fēng)干燥至麻體變硬。具體操作步驟如上描述，平行3份。

2.2 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗

Merck Purospher STAR色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相A-甲醇，B-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫（0～10 min，2% A；10～60 min， 2%～40% A）；流速1.0 mL·min^-1；檢測波長270 nm；柱溫35 ℃；進樣量10 μL。endprint

2.3 溶液的配制

2.3.1 混合對照品溶液的制備 精密稱取適量腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛和巴利森苷對照品，加10%甲醇分別制成單個對照品儲備液。分別精密量取各儲備液適量，加10%甲醇配制成混合對照品儲備液，上述5個化合物在混合對照品儲備液中的質(zhì)量濃度分別為15.2，303，49.7，5.03，710 mg·L^-1。

2.3.2 供試品溶液的制備 將天麻樣品粉碎（過3號篩），取粉末約 1 g，精密稱定，精密加入稀乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流提取3 h，放冷再稱定質(zhì)量，用稀乙醇補足失重，搖勻，過濾，取續(xù)濾液 10 mL，濃縮至近干，殘渣加10%甲醇溶解并稀釋至10 mL，搖勻，用0.45 μm 微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液，即得。

2.4 專屬性試驗

分別取混合對照品儲備溶液、供試品溶液，注入液相色譜儀中，色譜條件如上所述，進樣10 μL，測定，結(jié)果表明，在本色譜條件下腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛和巴利森苷分離度良好，在各出峰處均無雜質(zhì)峰干擾，見圖1。

2.5 線性關(guān)系考察

精密吸取上述混合對照品儲備液0.1，0.2，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0 mL，置2 mL量瓶中，10%甲醇定容至刻度，搖勻，分別進樣分析，進樣量為10 μL，各濃度重復(fù)2次，記錄各峰面積值，以峰面積平均值對質(zhì)量濃度進行線性回歸，得回歸方程分別為：腺苷y=18 712x-2 466.6，r=0.999 8；天麻素y=1 683.5x-1 815.6，r=0.999 9；對羥基苯甲醇y=7 341.2x-2 616.3，r=0.999 9；對羥基苯甲醛y=64 245x-3 220.3，r= 0.999 8；巴利森苷y = 908.66x-2 612.8，r= 0.999 8。

結(jié)果表明腺苷在0.761～15.3 mg·L^-1、天麻素在15.1～303 mg·L^-1、對羥基苯甲醇在2.49～49.7 mg·L^-1、對羥基苯甲醛在0.251～5.03 mg·L^-1、巴利森苷在35.5～710 mg·L^-1線性關(guān)系良好。

2.6 精密度試驗

取混合對照品溶液，按2.2項下色譜條件連續(xù)進樣6次，每次進樣10 μL，記錄腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛和巴利森苷的峰面積值，計算得其RSD分別為0.38%，0.45%，0.39%，0.46%，0.38%。

2.7 重復(fù)性試驗

稱取天麻粉末約1 g，共6份，精密稱定，按2.3.2項下制備樣品，記錄峰面積，腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛和巴利森苷的峰面積的RSD分別為1.3%，1.5%，1.2%，0.35%，0.56%。

2.8 穩(wěn)定性試驗

取同一供試品溶液10 μL，分別于制備后0， 4， 8， 12， 24， 48 h，按上述色譜條件進樣分析，測定腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森苷的峰面積，RSD分別為1.2%，1.4%，1.8%，2.4%，0.39%。表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 準確度試驗

精密稱取已知5個成分含量的天麻粉末約0.5 g，共9份。根據(jù)樣品中各成分含量的80%，100%與120%，分別加入新配制的對照品溶液各3份，按2.3.2項下方法制備成供試品溶液，進行HPLC分析，計算回收率。結(jié)果腺苷、天麻素、對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛、巴利森苷的加樣回收率分別為102.1%，98.38%，102.0%，101.5%，102.5%，RSD分別為1.7%，0.93%，1.7%，1.6%，1.5%，見表1。

2.10 樣品測定

2.10.1 有效成分含量測定 取不同加工方法的天麻樣品1 g，精密稱定，每份樣品平行3份，按2.3.2項下方法制備，得供試品溶液，并按上述色譜條件測定，計算5種成分的平均質(zhì)量分數(shù)，見表2。

2.10.2 二氧化硫殘留量的測定 根據(jù)2011年藥典委員會對2010年《藥典第一增補本》修訂后的二氧化硫殘留量測定法對樣品進行測定，見圖2。

3 討論

3.1 色譜條件的優(yōu)化

對單個對照品進行全波長掃描，發(fā)現(xiàn)各成分最大吸收波長有所不同，而在270 nm下均有較好的吸收，因此，最終確定檢測波長為270 nm。此外分別考察了甲醇-水、甲醇-甲酸水、乙腈-水、乙腈-甲酸水溶液等多個系統(tǒng)，及不同種類的酸和加入酸的比例對各成分分離效果的影響，結(jié)果表明甲醇-0.1%甲酸水系統(tǒng)分離效果較好。

3.2 供試品制備

試驗中考察了不同的提取溶劑（水、甲醇和乙醇）及其比例和不同的提取方法（超聲提取和回流提?。┑奶崛⌒ЧY(jié)果發(fā)現(xiàn)采用稀乙醇回流提取3 h，提取效果較好，這5種成分均能得到最佳提取且色譜峰峰形較好。

4 結(jié)論

在天麻蒸煮工藝比較中，經(jīng)煮制加工所得的天麻藥材中天麻素、對羥基苯甲醇、腺苷、對羥基苯甲醛、巴利森苷的含量均低于蒸制加工所得的天麻，從多指標成分角度分析，結(jié)果表明蒸制工藝優(yōu)于煮制工藝?？赡芤蛱炻樗匾妆慌c之共存的酶所分解，而天麻藥材在煮的過程中，投料后會造成水溫的急劇下降，從而加速酶解的過程，同時還會造成其他水溶性成分的溶解損失，因此煮法加工不利于保留天麻藥材中的有效成分。

熏蒸次數(shù)不同，腺苷的含量降低不同，熏蒸次數(shù)越多，腺苷含量越低；不同干燥程度時對天麻藥材進行硫磺熏蒸，對羥基苯甲醇、對羥基苯甲醛的含量降低幅度最多，而蒸制后直接熏蒸對其影響最大?？赡苁且驗榇祟惢钚猿煞志着cH₂SO₃發(fā)生酯化反應(yīng)[6]，直接熏蒸時含有水分較多，為該反應(yīng)提供了有利條件，從而使此類成分降低較多。巴利森苷為天麻素與檸檬酸縮合而成的酯類成分，因此，硫磺熏蒸對其含量影響較小。由圖2可以看出經(jīng)硫磺熏蒸后的天麻藥材二氧化硫殘留量均超過400 mg·kg^-1。不同程度硫磺熏蒸中趁鮮熏制時SO₂殘留量最高，五成干時熏蒸其次，八成干時熏蒸最低；熏蒸次數(shù)比較中熏蒸3次最高，熏蒸2次再次，熏蒸1次最少，但各次數(shù)之間的SO₂殘留量不成比例。熏蒸時的含水量越高，SO₂殘留量越多。endprint

綜上所述，煮法及硫磺熏蒸法均會影響天麻藥材有效成分的含量，且硫磺熏蒸法會使二氧化硫殘留量增加。因此，在產(chǎn)地加工時，應(yīng)不予以采用。

在實驗過程中蒸制時間、蒸制程度、熏蒸時間，熏蒸程度等，都可能會影響測定結(jié)果，因此制定規(guī)范化、標準化的操作規(guī)程尤為必要。本研究為制定天麻新鮮藥材加工干燥工藝規(guī)范提供了參考。

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Effects of different processing methods on effective components and

sulfur dioxide residue in Gastrodiae Rhizoma

NING Zi-wan， MAO Chun-qin， LU Tu-lin， JI De， LIU Jing， JI Lin， YANG Huan， WANG Fa-qin

（1.College of Pharmacy， Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210023， China；

2. Key Research Laboratory of Chinese Medicine Processing of Jiangsu Province， Nanjing 210023， China）

[Abstract] The contents of adenosine， gastrodin， 4-hydroxybenzyl alcohol， 4-hydroxybenzaldehyde， parishin and sulfur dioxide residue were compared in differently-processed Gastrodiae Rhizoma to provide the basis for a reasonable processing method of Gastrodiae Rhizoma. The analysis was performed on a Merck Purospher STAR column （4.6 mm×250 mm， 5 μm） with a mobile phase consisting of methanol and water （containing 0.1% formic acid） under gradient elution at a flow rate of 1.0 mL · min^-1. The eluates were detected at 270 nm， and the column temperature was 35 ℃. The content of adenosin， gastrodin， 4-hydroxybenzyl alcohol， 4-hydroxybenzaldehyde and parishin in processing of boiling or sulfur-fumigated were lower than that of in processing of steaming. Furthermore， the sulfur dioxide residue of sulphur-fumigated groups exceed 400 mg·kg^-1. This stable and reliable method will contribute to the quality control of different processed Gastrodiae Rhizoma.

[Key words] Gastrodiae Rhizoma； processing methods； sulfur-fumigated； HPLC； effective component

doi：10.4268/cjcmm20141505

[責(zé)任編輯 孔晶晶]endprint