耿 姍 葛華雯 王新宇 梁 濤

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023）

·研究報告·

附子及附子、干姜配伍對H2O2導(dǎo)致心肌細(xì)胞損傷的抗氧化作用*

耿 姍 葛華雯 王新宇 梁 濤△

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210023）

目的 觀察附子及附子、干姜配伍對H2O2誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞抗氧化作用。方法 取1～3 d乳鼠的心肌細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)，觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)，以免疫組化進(jìn)行心肌細(xì)胞純度鑒定。實驗分為對照組、模型組、附子水煎液組20 mg/mL，附子干姜水煎液組20 mg/mL，預(yù)處理2 h后，用1 mmol/L H2O2氧化損傷2 h，檢測培養(yǎng)液中心肌細(xì)胞跳動頻率，丙二醛（MDA）及超氧化物歧化酶（SOD）活性。結(jié)果 與模型組相比，用附子水煎液和附子干姜水煎液預(yù)處理后的心肌細(xì)胞跳動頻率增加 （P＜0.01），附子干姜水煎液組SOD活性明顯提高 （P＜ 0.01）。結(jié)論 附子干姜水煎液對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有一定的保護(hù)作用。

心肌細(xì)胞 附子 干姜 丙二醛 超氧化物歧化酶

中藥的藥性是中藥理論的核心，也是中醫(yī)理論指導(dǎo)下使用藥物的依據(jù)。附子與干姜同屬辛熱，兩者辛熱同施，是熱熱配伍的典型代表［1］。干姜附子湯由干姜、附子配伍組成，方中附子辛熱有毒，為純陽之品，具有回陽救逆助陽補(bǔ)火散寒止痛的功效，多用于亡陽虛脫肢冷脈微等陽虛或亡陽的患者；干姜辛熱無毒，具有溫中散寒回陽通脈溫肺化飲的功效。已有文獻(xiàn)報道，姜附湯對阿霉素心臟毒性具有一定保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抗氧化作用有關(guān)，同時也有研究認(rèn)為，姜附湯的化學(xué)成分研究提示，干姜與附子均含有抗氧化成分［2-3］，本實驗通過細(xì)胞水平，采用H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷，觀察附子水煎液和附子、干姜水煎液抗氧化應(yīng)激的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 日齡1～3 d的SD乳鼠，清潔級，雌雄不限，動物合格證號SCXK（滬）：2007-0005，由上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司提供。

1.2 試藥與儀器 附子（黑順片）、干姜原藥材購于南京解放軍第454醫(yī)院藥劑科。DMEM培養(yǎng)基：Gibco。胎牛血清：浙江天杭生物科技有限公司。一抗（α-Sarcomeric actin）：南京建成生物工程研究所。膠原酶Ⅰ型：Sigma；5-溴脫氧尿嘧啶：Sigma。胰蛋白酶：Sigma。超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）測試試劑盒：南京建成生物工程研究所。IX51倒置相差顯微鏡，日本Olympus產(chǎn)品。孵箱：上海精宏實驗設(shè)備有限公司?？鞠洌荷虾Ｊバ揽茖W(xué)儀器有限公司101AS-3。SyneRgy HT酶標(biāo)儀：美國Bio-Tek。

1.3 心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)［4］改良，取SD大鼠無菌開胸，暴露心臟，于心臟收縮期剪下心臟，放于預(yù)冷的盛有1%雙抗的Hank’s液的培養(yǎng)皿中，清洗后移至培養(yǎng)皿中，將心尖剪為1 mm3碎塊，加入0.1%Ⅰ型膠原酶和0.06%胰蛋白酶的混合酶4 mL，消化10 min，反復(fù)消化2～3次，每次30 min，至組織消化成半透明狀時終止消化，200目細(xì)胞篩過濾至預(yù)冷的完全培養(yǎng)基，1000 r/min離心10 min，加20%DMEM吹勻。細(xì)胞懸液放CO2培養(yǎng)箱差速培養(yǎng)60 min去除成纖維細(xì)胞，2 d后第1次換液，培養(yǎng)前3 d加入0.1 mmol/L 5-溴脫氧尿嘧啶抑制成纖維細(xì)胞生長。

1.4 心肌細(xì)胞的免疫組化鑒定 將爬有細(xì)胞的蓋玻片用PBS洗2遍，然后加入4%的多聚甲醛固定1～5 h。將固定好的細(xì)胞爬片加幾滴PBS覆蓋15 min，然后用PBS洗3遍。在爬片上加1%的triton-100，室溫放置15 min。PBS浸泡5 min，清洗3次，加滅活酶，洗滌，加入一抗（α-Sarco-meric actin，α-SCA）100 μL，37℃，濕盒孵育2 h，洗滌，加入 HRP標(biāo)記二抗 50 μL，室溫37℃，孵育30 min，洗滌，DAB法顯色。在光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。陽性結(jié)果判斷：以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕褐色為陽性，非心肌細(xì)胞不著色為陰性。

1.5 附子和附子干姜湯對H2O2誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞損傷的氧化作用 將處理好的心肌細(xì)胞分為對照組和模型組。對照組：以含10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)細(xì)胞；模型組：在培養(yǎng)基中加入終濃度為1 mmol/L的H2O2孵育2 h；附子水煎液組：培養(yǎng)后，加入20 mg/mL附子水煎液預(yù)處理2 h，再在培養(yǎng)基中加入終濃度為1 mmol/L的H2O2孵育2 h；附子干姜水煎液組：培養(yǎng)后，加入20 mg/mL附子干姜水煎液預(yù)處理2 h，再在培養(yǎng)基中加入終濃度為1 mmol/L的H2O2孵育2 h。

1.6 指標(biāo)檢測 （1）心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察：培養(yǎng)48 h后，在倒置顯微鏡下觀察心肌細(xì)胞形態(tài)、生長狀態(tài)、搏動頻率，以判斷心肌細(xì)胞生長狀況是否良好。（2）心肌細(xì)胞免疫組化鑒定：判斷是否是心肌細(xì)胞以及陽性表達(dá)率。（3）對H2O2誘導(dǎo)的乳鼠心肌細(xì)胞損傷的檢測：①不同處理后的心肌細(xì)胞，顯微鏡下觀察并計數(shù)心肌細(xì)胞的搏動頻率。②酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液MDA水平與SOD活性，嚴(yán)格按照試劑盒說明書的步驟操作。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 運用SPSS15.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（s）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 由倒置相差光學(xué)顯微鏡下可見，剛接種的心肌細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)液中，培養(yǎng)4～ 6 h后，細(xì)胞開始貼壁生長；培養(yǎng)24 h后，部分細(xì)胞逐漸變?yōu)樗笮位蚨噙呅?，逐漸在瓶壁表面鋪展；培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞在瓶壁鋪展?fàn)顩r更加明顯，形成不規(guī)則的星形，并伸出偽足，部分細(xì)胞開始搏動。培養(yǎng)72 h后，部分細(xì)胞交織成網(wǎng)，形成一片，單個細(xì)胞或片狀細(xì)胞自律搏動，搏動節(jié)律、強(qiáng)度穩(wěn)定。見圖1。

圖1 倒置相差顯微鏡下乳鼠心肌細(xì)胞的形態(tài)

2.2 心肌細(xì)胞免疫組化鑒定 見圖2。經(jīng)免疫組化鑒定，在光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。陽性結(jié)果判斷：以細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)棕褐色為陽性，非心肌細(xì)胞不著色為陰性，心肌細(xì)胞陽性率達(dá)95%以上，提示心肌細(xì)胞純度較理想。

圖2 α-SCA陽性心肌細(xì)胞（100倍）

2.3 附子和附子干姜湯對H2O2損傷心肌細(xì)胞跳動頻率、SOD及MDA的影響 見表1。由表1可知，模型組MDA值顯著高于對照組（P＜0.01），而跳動頻率和SOD值顯著低于對照組（P＜0.01），附子干姜水煎液可減少H2O2損傷后跳動頻率下降，使細(xì)胞內(nèi)SOD含量增加，與模型組相比差異明顯（P＜0.01），但在降低MDA含量方面，僅有下降趨勢。附子水煎液可明顯增加H2O2損傷后跳動頻率，但對MDA和SOD影響不大。

表1 各組H2O2損傷心肌細(xì)胞跳動頻率和SOD、MDA水平比較（s）

表1 各組H2O2損傷心肌細(xì)胞跳動頻率和SOD、MDA水平比較（s）

與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組比較，△P＜0.01。

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3 討 論

在出生1～3 d的新生大鼠，心肌細(xì)胞具有部分增殖能力［4］，在乳鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)過程中，消化酶及其濃度的選擇很重要，有用Ⅰ型膠原酶和胰蛋白酶的混合酶或Ⅱ型膠原酶和胰蛋白酶的混合酶作為消化酶［5-6］。由于胰蛋白酶能分解組織間的蛋白，且對細(xì)胞膜有較強(qiáng)破壞作用，膠原酶作用比較溫和，但難以消化完全，需要時間較長［7］。本實驗采用0.1%Ⅰ型膠原酶和0.06%胰蛋白酶的混合酶分步消化，以減輕胰蛋白酶或膠原酶對心肌細(xì)胞的損傷。本實驗通過差速貼壁60 min，可去除大量成纖維細(xì)胞，加入終濃度為0.1 mmol/L的Brdu來抑制成纖維細(xì)胞的DNA和蛋白質(zhì)的合成，從而達(dá)到純化心肌細(xì)胞的目的，通過免疫組化鑒定，心肌細(xì)胞陽性率達(dá)95%以上。

目前已有文獻(xiàn)報道，干姜與附子具有抑制心肌氧化反應(yīng)和超氧陰離子自由基產(chǎn)生的作用［8］。MDA是脂質(zhì)過氧化應(yīng)激反應(yīng)的終產(chǎn)物，SOD是機(jī)體內(nèi)重要的抗氧化應(yīng)激酶。本實驗結(jié)果顯示，附子及附子干姜水煎液組具有增加心肌細(xì)胞跳動頻率，強(qiáng)心作用；在氧化應(yīng)激方面，附子干姜水煎液組提高SOD活性明顯優(yōu)于附子組，附子單用在提高SOD活性方面不明顯；但在降低MDA活性方面，附子水煎液及附子干姜水煎液均作用不明顯，僅有下降趨勢，目前原因并不清楚，附子干姜抗氧化應(yīng)激深入機(jī)制有待于今后進(jìn)一步研究。

［1］ 黃穎，武乾，石曉路，等.附子、干姜配伍機(jī)制現(xiàn)代研究概述［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2013，31（9）：1884.

［2］ 柳乃奎，黃雪松．脫氫姜酮、姜酚肟對兩種自由基的清除作用［J］．食品科學(xué)，2004，25（6）：72．

［3］ 劉古鋒，吳偉康，段新芬，等．附子多糖對力竭運動小鼠心肌過氧化損傷的保護(hù)作用［J］.海南醫(yī)學(xué)，2008，9（7）：68-69．

［4］ 孟云輝，李永新，于慧卿，等.新生SD大鼠心肌細(xì)胞的原代培養(yǎng)［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2014，12（1）：78-79.

［5］ 王佳南，張曉剛，湯為學(xué)，等.新生大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法的改良［J］.重慶醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2009，34（5）：600-603.

［6］ 張乃菊，陳天平，祝曉光.乳鼠心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)［J］.蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2010，35（6）：558-561.

［7］ 郭舜，張樹江，段蕊，等.新生SD大鼠心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)方法改進(jìn)［J］.中藥藥理與臨床，2012，28（6）：139-141.

［8］ 吳偉康，羅漢.四逆湯清除氧自由基及抑制心肌脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的體外實驗［J］．中國中藥雜志，1995，11（20）：701-702.

Antioxidant Effect of Aconite and Compatibility of Aconite dried and Ginger on Neonatal Rats'Myocardial Cells induced by H2O2

GENG Shan，GE Huawen，WANG Xinyu，et al. Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Jiangsu，Nanjing 210023，China

Objective：To investigate the antioxidant effect of aconite and compatibility of aconite dried ginger pretreatment on neonatal rat myocardial cells induced by H2O2.Methods：Myocardial cells were clipped from 1～3 days of neonatal rat.Cell morphologic change was observed under an inverted microscope and purity identification of myocardial cells were studied by immunohistochemistry.Different groups were set after conventional cultur，such as normal groups，the model groups，20 mg/kg aconite decoction groups，20 mg/kg aconite and dried ginger decoction.After pretreatment 2 hours and the 1 mmol/L H2O2oxidative injury 2 hours.The different groups were observed about cell pulsating.The activity of MDA and SOD was detected.Results：Compared with model groups，in the aconite and dried ginger decoction pretreatment group，the beating rate of the myocardial cell was increased（P＜0.01）.The SOD activity were also improved（P＜0.01）.Conclusion：It has the protective effect of the aconite and dried ginger decoction on myocardial injury induced by the H2O2.

Myocardial cells；Aconite；Dried ginger；MDA；SOD

R285.5

A

1004-745X（2014）11-2012-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2014.11.019

2014-07-23）

南京中醫(yī)藥大學(xué)國家自然基金預(yù)研基金（12XYY08）

△通信作者