王小梅 張維倩 任梅江 郭偉男

子癇前期患者胎盤組織中TNF-α、Caspase-3表達(dá)的研究

王小梅 張維倩 任梅江 郭偉男

目的 探討TNF-α、Caspase-3在子癇前期患者胎盤組織中的表達(dá)及意義。方法 子癇前期患者60例(包括子癇前期輕度、子癇前期重度各30例)為實(shí)驗(yàn)組, 正常妊娠婦女30例為對(duì)照組, 利用免疫組織化學(xué)SP法檢測(cè)兩組胎盤組織中TNF-α、Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果 實(shí)驗(yàn)組TNF-α的表達(dá)均較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05), 且隨著子癇前期的病情加重, TNF-α的表達(dá)逐漸增加。實(shí)驗(yàn)組Caspase-3的表達(dá)均較對(duì)照組明顯升高(P＜0.05), 且隨著子癇前期病情的加重, Caspase-3的表達(dá)逐漸增加。結(jié)論 TNF-α、Caspase-3在患者胎盤組織中隨病情的加重逐漸升高的表達(dá), 有助于預(yù)測(cè)子癇前期的發(fā)生發(fā)展。

TNF-α；Caspase-3；子癇前期；胎盤組織

子癇前期是妊娠期特有的疾病, 是妊娠期高血壓疾病的一種較嚴(yán)重類型。病變可累及多個(gè)器官, 嚴(yán)重影響母嬰健康, 為孕產(chǎn)婦和圍生兒高發(fā)病率及死亡率的主要原因之一。有研究表明, 血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是子癇前期發(fā)病及病理變化的重要環(huán)節(jié), 而TNF-α對(duì)血管內(nèi)皮有直接的損傷作用［1］。Caspase-3是細(xì)胞凋亡中的重要蛋白酶, 已有研究表明, 胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡和壞死形成的合體滋養(yǎng)細(xì)胞微粒增多是子癇前期發(fā)生的一個(gè)原因［2］。本研究通過測(cè)定TNF-α、Caspase-3在患者胎盤組織中的表達(dá), 觀察其與子癇前期的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇于2012年5月～2014年1月在本院產(chǎn)科住院分娩的子癇前期患者60例(包括子癇前期輕度、子癇前期重度各30例)為實(shí)驗(yàn)組, 其中子癇前期輕度患者的平均年齡(29.12±4.35)歲, 平均孕周(38.03±1.98)周；子癇前期重度患者平均年齡(29.34±4.03)歲, 平均孕周(37.78±2.17)周。選擇同期在本院分娩的正常妊娠婦女30例為對(duì)照組,平均年齡(29.23±5.41)歲；平均孕周(38.10±1.89)周(37～42周)。所有研究對(duì)象均無多胎妊娠、無反復(fù)流產(chǎn)史、未經(jīng)生殖技術(shù)幫助、無慢性高血壓、糖尿病、無心血管疾病、慢性肝病腎病病史及免疫系統(tǒng)疾病。兩組孕婦一般資料比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 子癇前期輕度, 子癇前期重度的診斷標(biāo)準(zhǔn)參照謝幸、茍文麗第8版婦產(chǎn)科學(xué)［3］。

1.3 主要試劑 兔抗人TNF-α多克隆抗體購(gòu)自北京博奧森物技術(shù)有限公司。鼠抗人Caspase-3多克隆抗體、SP免疫組化系列工作液試劑盒、DAB顯色液均購(gòu)自北京中衫金橋生物技術(shù)有限公司。具體操作參照試劑盒說明書。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 三組孕婦均于胎盤娩出后20 min內(nèi)采集標(biāo)本,從胎盤母體面中央切取胎盤組織約1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm, 注意避開梗死及鈣化區(qū)。用生理鹽水反復(fù)沖洗, 用10%中性福爾馬林溶液固定24 h以上, 常規(guī)制成石蠟組織塊。采用免疫組化SP法測(cè)定胎盤組織中TNF-α、Caspase-3的表達(dá)。試驗(yàn)設(shè)PBS代替一抗作為空白對(duì)照。

1.5 結(jié)果判定 將根據(jù)細(xì)胞內(nèi)染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)分級(jí)。根據(jù)染色強(qiáng)度分級(jí)：無染色或染色不清計(jì)為0分；淡黃色計(jì)為1分；少量深棕色顆粒計(jì)為2分；大量深棕色或褐色顆粒計(jì)為3分。估算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)：無陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)0分；＜25%計(jì)1分；25%～50%計(jì)2分；＞50%計(jì)3分。取以上兩項(xiàng)積分之和：積分0～1分為(-)；2～3分為(+)；4～5分為(+)；＞5分為(+++)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)均采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理, 計(jì)量資料采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn)；變量間的相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TNF-α、Caspase-3兩者在對(duì)照組及子癇前期輕度、子癇前期重度中的表達(dá)。

2.1.1 TNF-α的表達(dá) 胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)可見TNF-α棕黃色陽(yáng)性顆粒, 其主要表達(dá)于胞漿和胞膜。對(duì)照組胎盤組織中未見或僅見少量弱陽(yáng)性細(xì)胞。而子癇前期輕度及重度組中TNF-α的表達(dá)量明顯增加。TNF-α在對(duì)照組的表達(dá)陽(yáng)性率53.34%, 在子癇前期輕度組胎盤中表達(dá)的陽(yáng)性率為83.33%,在子癇前期重度組胎盤中表達(dá)的陽(yáng)性率約為96.67%。TNF-α在對(duì)照組、子癇前期輕度組及子癇前期重度組三組間均有不同程度的表達(dá), 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 且隨著子癇前期的病情加重, TNF-α的表達(dá)逐漸增加。見表1。

表1 免疫組化中TNF-α在三組的表達(dá)［n(%)］

2.1.2 Caspase-3的表達(dá) 胎盤絨毛小葉的合體滋養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)可見Caspase-3棕黃色陽(yáng)性顆粒, 主要表達(dá)于細(xì)胞漿, 部分于細(xì)胞核陽(yáng)性表達(dá)。對(duì)照組胎盤組織中未見或僅見少量弱陽(yáng)性細(xì)胞, 而子癇前期輕度及重度組中Caspase-3的表達(dá)量明顯增加。Caspase-3在對(duì)照組的中胎盤表達(dá)的陽(yáng)性率為46.66%,在子癇前期輕度組胎盤中表達(dá)的陽(yáng)性率為80.00%, 在子癇前期重度組胎盤中表達(dá)的陽(yáng)性率約為93.33%。Caspase-3在對(duì)照組、子癇前期輕度組及子癇前期重度組三組間均有不同程度的表達(dá), 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05), 且隨著子癇前期的病情加重Caspase-3的表達(dá)逐漸增加。見表2。

表2 免疫組化中Caspase-3在三組的表達(dá)［n(%)］

2.2 Caspase-3和TNF-α的相關(guān)性分析 子癇前期組：子癇前期輕度組兩者呈正相關(guān), 相關(guān)系數(shù)r=0.678, P=0.008＜0.05；子癇前期重度組兩者呈正相關(guān), 相關(guān)系數(shù)r=0.820, P=0.021＜0.05。對(duì)照組：兩者呈正相關(guān), 相關(guān)系數(shù)r=0.542, P=0.000＜0.05。

3 討論

子癇前期是妊娠期特有的疾病, 是妊娠期高血壓疾病的嚴(yán)重類型, 其發(fā)病原因尚未完全闡明［4］。目前研究認(rèn)為,血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷釋放血管活性物質(zhì), 是導(dǎo)致高血壓病的先兆［5］, 也是子癇前期病理變化的中心環(huán)節(jié)［6］。由于終止妊娠后多數(shù)患者的病理變化可以逆轉(zhuǎn), 這說明胎盤在子癇前期的發(fā)病中起著重要的作用［7］。

妊娠期母體會(huì)出現(xiàn)一系列血管炎性反應(yīng)的適應(yīng)性變化,而子癇前期則使這種適應(yīng)性變化發(fā)生紊亂。蛻膜中的細(xì)胞數(shù)量大大增加, 其激活時(shí)釋放的有害物質(zhì)造成內(nèi)皮損傷。TNF-α、IL-6和IL-8等細(xì)胞因子被命名為促炎性細(xì)胞因子, 這些細(xì)胞因子在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中起重要作用, 調(diào)解著機(jī)體的生理功能, 而這些細(xì)胞因子又可以導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)與功能的改變。有研究表明, TNF-α對(duì)血管內(nèi)皮有直接的損傷作用, 并且妊娠高血壓病患者血中TNF-α含量的增高與血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷呈正相關(guān)［8］。而TNF-α在子癇前期的氧化應(yīng)激中產(chǎn)生了重要作用, 造成產(chǎn)生吞噬脂質(zhì)的巨噬細(xì)胞、血小板減少, 微血管凝血, 毛細(xì)血管通透性增加,致使脂質(zhì)過氧化物產(chǎn)生增多, 從而損傷內(nèi)皮。本實(shí)驗(yàn)利用免疫組化法檢測(cè)了正常孕婦、子癇前期輕度與重度患者胎盤中TNF-α的表達(dá)。結(jié)果表明后兩者中TNF-α的表達(dá)較正常妊娠胎盤明顯增高。體外實(shí)驗(yàn)證明, TNF-α可使血管內(nèi)皮出現(xiàn)如下形態(tài)學(xué)改變：血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯拉長(zhǎng)變形, 成為棱形甚至伸出長(zhǎng)長(zhǎng)的偽足；細(xì)胞表面微絨毛明顯縮短甚至脫落,且有的細(xì)胞表面絨毛呈泡狀結(jié)構(gòu), 可見細(xì)胞膜表面有缺損［9］, 胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張, 線粒體濃縮、深染；細(xì)胞間連接疏松, 紅細(xì)胞可漏出管腔［10］。TNF-α除對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞造成直接損傷外, 還可能導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的功能紊亂, 如增加血管收縮因子(如內(nèi)皮素)的生成和釋放, 減少血管舒張因子(如一氧化氮)的生成和釋放, 使血管調(diào)節(jié)因子失衡［11］。以上形態(tài)改變可致使血管受損、通透性增加和痙攣, 而導(dǎo)致血壓升高、蛋白尿和全身水腫。

Caspase-3屬于Caspase蛋白家族, 該類蛋白的活性部位為極保守的半胱氨酸殘基(以字母C代表), 它能特異性地切割(用aspase代表)天冬氨酸。Caspase-3是細(xì)胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶, 主要表達(dá)于胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞。研究表明, 胎盤合體滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡和壞死形成的合體滋養(yǎng)細(xì)胞微粒(STBMs)在母體血液循環(huán)的增多是子癇前期發(fā)生的一個(gè)原因。合體滋養(yǎng)細(xì)胞微粒可誘導(dǎo)單核細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL-12、IL-18和INF-γ等炎性細(xì)胞因子［12］, 而且合體滋養(yǎng)細(xì)胞微粒是單核細(xì)胞強(qiáng)有力的活化劑, 通過 NF-κB(是將信息從胞漿傳至胞核引起相應(yīng)基因表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子)信號(hào)傳達(dá)通路觸發(fā)炎癥系統(tǒng)［13］。另一方面, 同型半胱氨酸可以促進(jìn)氧自由基的生成, 進(jìn)而損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞, 致其功能紊亂［14］。而Caspase-3在子癇前期胎盤組織中表達(dá)增多, 證明其合體滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡比正常妊娠組多, 相比于正常妊娠而言, 合體滋養(yǎng)細(xì)胞微粒進(jìn)入母體血液循環(huán)增多, 繼而導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生和發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)證實(shí), Caspase-3在各組的胎盤中均呈陽(yáng)性表達(dá), 主要分布在胎盤的合體滋養(yǎng)細(xì)胞細(xì)胞漿, 部分分布于細(xì)胞核, 并且隨著子癇前期病情的加重而表達(dá)增加。

因此, 本實(shí)驗(yàn)表明TNF-α、Caspase-3在對(duì)照組、子癇前期輕度組及子癇前期重度組的表達(dá)程度不同, 隨子癇前期病情進(jìn)展, 二者的表達(dá)分別逐漸升高, 可能為該病發(fā)病的重要原因。病理性妊娠患者的胎盤中大量的TNF-α表達(dá),刺激更多的炎性因子釋放, 加重血管內(nèi)皮損傷, 且TNF-α、Caspase-3成正相關(guān), 緊密聯(lián)系, 相互影響, 共同參與子癇前期發(fā)生及胎盤的病理改變。因此從分子生物學(xué)水平上的進(jìn)一步研究, 有望揭示子癇前期的確切機(jī)制, 從而為該病的早期預(yù)防、早期治療提供有力的理論依據(jù)。

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2014-05-05］

050800 正定縣婦幼保健院