張春梅，王麗娜，劉永亮(河北省唐山市人民醫(yī)院神經外科，河北 唐山 063000)

·論著·

丁苯酞對局灶性腦梗死大鼠皮層Rho相關激酶Ⅱ蛋白表達的影響

張春梅，王麗娜，劉永亮*
(河北省唐山市人民醫(yī)院神經外科，河北 唐山 063000)

目的探索丁苯酞對局灶性腦梗死大鼠模型皮層Rho相關激酶Ⅱ(Rho-associated kinase Ⅱ,ROCKⅡ)表達的影響。方法成年Sprague-Dawley 雄性大鼠45只，隨機分為假手術組15只，對照組15只，丁苯酞組15只。應用光化學法建立局灶性腦梗死大鼠模型。術后24h行干濕質量法檢測各組大鼠腦組織含水量變化，行免疫組織化學和Western Blot檢測各組大鼠梗死區(qū)周圍皮層ROCKⅡ蛋白表達水平。結果與假手術組比較，對照組和丁苯酞組腦組織含水量明顯增加，梗死區(qū)周圍皮層ROCKⅡ蛋白表達明顯增加。丁苯酞組腦組織含水量較對照組降低，梗死區(qū)周圍皮層ROCKⅡ蛋白表達減少。結論丁苯酞可降低局灶性腦梗死大鼠皮層ROCKⅡ蛋白的表達，減輕腦水腫的形成。

腦梗死；丁苯酞；模型，動物

10.3969/j.issn.1007-3205.2014.09.004

腦水腫是腦梗死后的主要繼發(fā)性病理過程，可加重腦組織缺血缺氧，是導致患者病死率和殘疾率增高的主要原因之一[1]。Rho相關激酶(Rho-associatedkinase,ROCK)Ⅱ是Rho信號通路的重要底物之一，ROCKⅡ的激活可進而激活肌球蛋白輕鏈磷酸酶，導致肌球蛋白輕鏈磷酸化，血腦屏障通透性增高，腦水腫加重[2]。丁苯酞是治療急性缺血性腦血管病的一種新藥。本研究采用光化學法制造局灶性腦梗死大鼠模型，觀察丁苯酞對局灶性腦梗死大鼠腦水腫和ROCKⅡ蛋白表達水平的影響，旨在為丁苯酞的臨床應用探索新的證據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組：清潔級健康成年Sprague-Dawley雄性大鼠45只，體質量280～320g，3個月齡，購自北京維通利華公司，合格證為SCXL(京)2002-003。飼養(yǎng)于河北聯合大學動物飼養(yǎng)中心，自然光照，環(huán)境安靜，維持室溫在20～25℃，自由進食飲水。所有動物按隨機數字表法分為假手術組15只，對照組15只，丁苯酞組15只。丁苯酞組大鼠給予丁苯酞軟膠囊(石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司，應用植物油配制成100mg/mL)0.4mL/kg灌胃(1次/d)，假手術組和對照組給予0.4mL/kg植物油灌胃。所有實驗過程遵循國際生命指導中心“關心和使用動物實驗原則”。

1.2 模型制作：對照組和丁苯酞組大鼠采用10%水合氯醛3～5mL/kg腹腔麻醉，經尾靜脈注入光敏劑紅四氮唑(即玫瑰紅B)150mg/kg，SR-5立體定位儀(日本Narishige公司)固定大鼠頭部，常規(guī)消毒，沿正中線切開頭皮，暴露右側顱骨，于前囟右3mm后2mm處，磨鉆磨除直徑約6mm外層顱骨，LG-150綠色冷光源[徐州恒發(fā)有限公司，波長(560±30)nm，光照強度5.6×105，照射中心最高溫度為27℃]照射30min，縫合皮膚。假手術組僅尾靜脈注射生理鹽水，只暴露顱骨，磨除外板，照射時間同上。在實驗動物麻醉清醒后，應用Longa標準[3]進行大鼠行為學評分。0分，無缺陷；1分，不能伸展對側前肢；2分，對側前肢屈曲；3分，輕度向對側轉圈；4分，嚴重向對側轉圈；5分，向對側跌倒。評分1～3分者納入實驗，不符合標準者隨機補充。

1.3 腦組織含水量測定：隨機選取各組大鼠各5只，于術后24h采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，斷頭處死，開顱取腦，從梗死周圍區(qū)取200mg左右的腦組織，應用MA110電子分析天平(上海第二天平儀器廠)稱濕質量并記錄，然后置于105℃恒質量干燥箱內干燥48h至恒質量，稱干質量后按Elliot公式計算腦含水量。腦含水量計算公式=(濕質量-干質量)/濕質量×100%。

1.4 免疫組織化學染色法檢測梗死周圍皮質ROCKⅡ蛋白陽性細胞數量：隨機選取各組大鼠各5只，于術后24h采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛經左心室穿刺至主動脈進行灌注，斷頭取腦，置于4%多聚甲醛中4℃冰箱過夜，自紅色梗死灶前邊界向后冠狀切取2mm厚包含梗死區(qū)及左右半球的組織塊，自來水沖洗48h，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片機連續(xù)切片，片厚5μm。取各大鼠同部位切片3張，經二甲苯二級脫蠟各5min，梯度乙醇脫水，3%過氧化氫室溫浸泡10min以消除內源性過氧化物酶，高壓熱修復，滴加1∶100比例稀釋的ROCKⅡ一抗(武漢博士德生物工程有限公司)4℃過夜，次晨取出置常溫，磷酸鹽緩沖液沖洗，滴加二抗，37℃孵育1h，二氨基聯苯胺顯色，水沖洗后蘇木精復染，脫水，透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察細胞核呈藍色，陽性細胞腫脹，胞質黃染。在400倍顯微鏡下在梗死灶周圍隨機選取5個視野，應用ImagePro-Plus圖像分析系統(tǒng)5.0(美國MediaCybernetics公司)照相后計算每個視野中的陽性細胞數量。

1.5 蛋白質印跡法檢測梗死周圍皮質ROCKⅡ蛋白表達：應用細胞裂解液提取各組大鼠術后24h梗死周圍腦組織總蛋白(每組各5只)運用考馬斯亮藍比色法測定各個樣本蛋白含量，上樣量為100μg蛋白。15%SDSPAGE凝膠電泳，硝酸纖維素膜轉膜，5%脫脂奶粉封閉；加入山羊抗ROCKⅡ(rI′11r18/serl9)多克隆一抗(1∶500)(武漢博士德生物工程有限公司)、山羊抗β-肌動蛋白多克隆一抗(1∶1 000)(武漢博士德生物工程有限公司)，4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗(1∶1 000)(武漢博士德生物工程有限公司)。增強化學發(fā)光溶液(美國pierce公司)3min，曝光、顯影、定影。采用數碼成像分析系統(tǒng)軟件分析平均灰度值，取目標平均灰度值與內參平均灰度值的比值。

2 結 果

與假手術組相比，對照組和丁苯酞組大鼠梗死24h后腦組織含水量均顯著增高(P<0.05)；丁苯酞組大鼠梗死24h后腦組織含水量較對照組顯著降低(P<0.05)。在免疫組織化學試驗中，假手術組可見少量被染成棕黃色的陽性細胞；與假手術組相比，對照組和丁苯酞組梗死24h后梗死周圍陽性細胞數量均顯著增多(P<0.05)；丁苯酞組梗死24h后梗死周圍陽性細胞數量較對照組顯著減少(P<0.05)。在免疫印記試驗中，與假手術組比較，對照組和丁苯酞組梗死24h后梗死周圍腦組織ROCKⅡ含量均顯著增高(P<0.05)；丁苯酞組梗死24h后梗死周圍皮質ROCKⅡ含量較對照組顯著降低(P<0.05)。見表1。

GroupsBrainwatercontentROCKⅡ(Immunohistochemistry)ROCKⅡ(WesternBlot)Sham71．78±0．7238．20±10．4760．80±9．68Control79．33±0．49?195．60±15．31?121．00±12．79?Butylphthalide77．49±0．34?#124．20±16．33?#86．40±9．56?# F273．122152．56939．266 P0．0000．0000．000

*P<0.05vssham group #P<0.05vscontrol group byqtest
ROCKⅡRho-associated kinase Ⅱ

3 討 論

腦梗死是一種臨床常見的缺血性腦血管病，嚴重危害著人類的生命和健康。急性缺血性腦血管病可引起局部腦組織微循環(huán)障礙，缺血缺氧，甚至引起炎癥反應、自由基損傷、血腦屏障通透性增高等病理過程，導致腦水腫形成[4]。腦水腫形成后可進一步加重腦組織缺血缺氧，并且可引起顱內壓增高，甚至形成腦疝，明顯加重患者的癥狀，影響患者的預后[5]。因此，對腦水腫的形成機制及治療方法進行進一步的探討，對缺血性腦血管病的治療具有重要的指導意義。

Rho蛋白家族是Ras超家族小相對分子質量單體結合蛋白。Rho蛋白的主要功能是調節(jié)肌動蛋白細胞骨架的重建[6]。Rho蛋白通過Rho信號通路參與包括炎癥反應在內的多種生物學過程。ROCK是Rho的重要效應底物之一，是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶。本研究結果表明，ROCKⅡ參與了腦梗死的病理過程。當ROCK接受了Rho傳遞的活化信號，可發(fā)生多個氨基酸位點的磷酸化，包括肌球蛋白磷酸酶的磷酸化[7]。肌球蛋白磷酸酶磷酸化后活性消失，肌球蛋白輕鏈脫磷酸化受阻，使得胞漿內肌球蛋白輕鏈磷酸化水平增高，肌動蛋白微絲骨架聚合，血管內皮骨架發(fā)生變化，血管內皮收縮，內皮通透性增高[8]。我們推測，ROCKⅡ通過此途徑參與了腦梗死后腦水腫的發(fā)生。

丁苯酞是從芹菜籽中提取的一種有效成分，動物實驗提示，丁苯酞可以增加缺血區(qū)的腦組織的血流量，重建缺血區(qū)微循環(huán)；保護線粒體功能，改善腦組織能量代謝[9]。本研究結果顯示丁苯酞可通過調控ROCKⅡ的表達減輕腦梗死后腦水腫的形成。有研究[10]表明丁苯酞還能夠減少梗死區(qū)中性粒細胞數量以及白細胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)等炎性細胞因子的表達。細胞外血管緊張素Ⅱ和IL-1β可上調RhoA表達并增強其活性[11]。TNF-α可通過其受體激活RhoA，進而激活Rho三磷酸鳥苷酶，促進肌球蛋白輕鏈磷酸化，導致平滑肌對Ca2+的敏感性增高，肌動球蛋白收縮力增大，血管平滑肌收縮，從而加重細胞毒性腦水腫[12]。由此可見，腦缺血后的應激反應和炎癥反應與Rho信號通路密切相關。此外，丁苯酞還具有抑制腦缺血患者血清C反應蛋白表達的作用[13]，而唐淑俊等[14]的研究表明，炎性細胞因子和C反應蛋白與腦梗死后腦水腫的關系密切。我們推測，腦梗死引起的炎癥反應會激活RhoA，進而激活ROCK，導致肌球蛋白輕鏈磷酸化，血腦屏障通透性增高，腦水腫加重。而丁苯酞可通過抑制IL-1β和TNF-α的表達，抑制ROCK的激活，從而減輕腦梗死后腦水腫的形成。

[1] 陳通,孫善全.創(chuàng)傷性腦水腫發(fā)生機制的研究[J].四川解剖學雜志,2005,13(2):15-19.

[2] 唐華,趙合慶.Rho/ROCK與神經系統(tǒng)疾病[J].國際腦血管病雜志,2008,16(3),233-236.

[3] 屈秋民，曹振玲，楊劍波.線栓法大鼠大腦中動脈閉塞局灶性腦缺血模型longa法和小泉法的比較[J].中華神經外科雜志,2000,22(5):289-291.

[4] 丁潔,程焱.Rho/Rho激酶信號通路與缺血性腦血管病[J].國際腦血管病雜志,2007,15(9):707-710.

[5] 高艷,謝敏.Rho/Rho激酶信號通路與低氧所致肺纖維化[J].國際呼吸雜志,2009,29(18):1120-1126.

[6] 趙世義.Rho蛋白及其抑制劑[J].國際腫瘤學雜志,2008,35(2):110-112.

[7] 李琴,李曉宇,劉皋林.Rho激酶的生理及病理生理研究進展[J].中國藥學雜志,2011,46(24):1860-1864.

[8] 劉薇薇,崔桂云,沈霞.Rho激酶與缺血性腦血管病[J].國際腦血管病雜志,2009,17(8):626-635.

[9] 劉永亮,王麗娜,李建民，等.丁苯酞對局灶性腦梗死大鼠腦水腫及咬合蛋白表達的影響[J].臨床神經外科雜志,2013,10(3):156-158.

[10] XU HL,FENG YP.Inhibitory effects of chiral 3-n-butylphthalide on inflammation following focal ischemic brain injury in rats[J].Acta Pharmacol Sin,2000,21(5): 433-438.

[11] HIROKI J,SHIMOKAWA H,HIGASHI M,et al.Inflammatory stimuli upregulate Rho-kinase in human coronary vascular smooth muscle cells[J].J Mol Cell Cardiol,2004,37(2): 537-546.

[12] DOE C,BENTLEY R,BEHM DJ,et al.Novel Rho kinase inhibitors with anti-inflammatory and vasodilatory activities[J].J Pharmacol Exp Ther,2007,320(1): 89-98.

[13] 朱海生.丁苯酞對慢性腦供血不足患者血清高敏C反應蛋白的影響[J].中華實用診斷與治療雜志,2012,26(1):73-74.

[14] 唐淑俊,梅鳳君.炎性細胞因子和C-反應蛋白在急性腦梗死中的變化及相關性研究[J].河北醫(yī)科大學學報,2010,31,(11):1347-1350.

(本文編輯：許卓文)

BUTYLPHTHALIDEONCORTEXEXPRESSIONOFRHO-ASSOCIATEDKINASEⅡINRATSAFTERFOCALCEREBRALINFARCTION

ZHANGChunmei,WANGLina,LIUYongliang*
(DepartmentofNeurosurgery,TangshanPeople′sHospitalofHebeiProvince,Tangshan063000,China)

ObjectiveToexploretheeffectofbutylphthalideonthecortexexpressionofRho-associatedkinaseⅡ(ROCKⅡ)inratsafterfocalcerebralinfarction.MethodsForty-fiveSprague-Dawleymaleratsweredividedintoshamgroup,controlgroupandbutylphthalidegroup.Themodelwasmadebyphotochemicalmethod.Afterinjury24h,brainwatercontentwasmeasuredtoobservethechangesofthebrainedema,theimmunohistochemistryandWesternBlotweredonetoexaminethecortexexpressionofROCKⅡaroundtheinfarctionarea.ResultsComparedwiththeshamgroup,thebrainwatercontentofthecontrolgroupwasmoreenhanced,thecontentofROCKⅡaroundtheinfarctionareawasincreased.Comparedwiththecontrolgroup,thebrainwatercontentofthebutylphthalidegroupwasless,thecontentofROCKⅡaroundtheinfarctionareaofbutylphthalidegroupwasdecreased.ConclusionButylphthalidecouldreducethecortexexpressionofROCKⅡinratsafterfocalcerebralinfarction,andthusalleviatethebrainedema.

braininfaction;butylphthalide;modes，animal

2014-02-22；

2014-04-30

張春梅(1973-)，女，河北唐山人，河北省唐山市人民醫(yī)院主管護師，醫(yī)學學士，從事重癥護理研究。

*通訊作者

R743.33

A

1007-3205(2014)09-1003-03