鐘金寶 王麗麗 王翌羽 謝榮輝 殷嫦嫦

(1九江學院基礎(chǔ)醫(yī)學院2011級本科生；2九江學院基礎(chǔ)醫(yī)學院 江西九江 332000；

3南昌大學研究生院醫(yī)學部 江西南昌 330006)

響應(yīng)面分析法優(yōu)化黃芩總黃酮提取工藝的研究*

鐘金寶1王麗麗2王翌羽1謝榮輝3殷嫦嫦2

(1九江學院基礎(chǔ)醫(yī)學院2011級本科生；2九江學院基礎(chǔ)醫(yī)學院 江西九江 332000；

3南昌大學研究生院醫(yī)學部 江西南昌 330006)

目的優(yōu)選超聲波法提取黃芩總黃酮的工藝條件，為工業(yè)化生產(chǎn)黃芩總黃酮提供參考。方法采用超聲波法提取黃芩總黃酮，對使用Al(NO3)3-NaNO2顯色法測定黃芩總黃酮進行方法學考察；選取乙醇濃度、液固比、提取時間3個影響因素進行Box- Benhnken中心組合設(shè)計，利用響應(yīng)面分析法(RSM)對提取工藝參數(shù)進行優(yōu)化。結(jié)果方法學考察結(jié)果表明本實驗室采用Al(NO3)3-NaNO2顯色法測定黃芩總黃酮及超聲提取工藝可靠；提取黃芩總黃酮最佳提取工藝為：乙醇濃度60%，液固比40mL/g，提取時間45min；預測值為1.776%，實際得率為1.704%，兩者吻合度較高。結(jié)論Box-Benhnken設(shè)計結(jié)合響應(yīng)面分析法對黃芩總黃酮提取工藝進行優(yōu)化既方便又快捷，得出的參數(shù)可信度高、實用性好。

黃芩，總黃酮，響應(yīng)面分析法，提取

黃芩(Scutellariae baicalensis)為唇形科(Labiatae)植物，臨床上用其干燥的根入藥在國內(nèi)外已有久遠的歷史，其性寒味苦，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功效[1]。黃芩的化學成分有黃酮類化合物，揮發(fā)油、萜類化合物、多糖、β-谷甾醇、苯甲酸、黃芩酶、黃芩苷、萜類和微量元素等已被證實[2]。隨著黃芩化學成分和現(xiàn)代藥理作用的深入研究，國內(nèi)外學者發(fā)現(xiàn)黃芩中的黃酮類化合物，黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素等具有較強的抗腫瘤作用[3-5]，另外黃芩總黃酮還被證實有抗病毒和神經(jīng)保護作用[6-7]。超聲波提取法具有方便、節(jié)能、耗時短、得率高等特點[8]，利用此法結(jié)合乙醇作為提取溶劑提取黃芩總黃酮保證了黃酮的得率和純度。因此目前常采用超聲波輔助法提取黃芩總黃酮，但超聲波輔助法提取黃芩總黃酮最優(yōu)提取條件尚未完全清楚，本研究在方法學考察和單因素試驗的基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面分析法(RSM)[5]優(yōu)化黃芩總黃酮超聲提取工藝，探索黃芩總黃酮超聲提取的最優(yōu)條件，為高效提取黃芩總黃酮提供理論依據(jù)。

1 材料、儀器與方法

1.1材料

黃芩(Scutellariae baicalensis)購于九江市中醫(yī)醫(yī)院中藥房，經(jīng)九江學院基礎(chǔ)醫(yī)學院藥學系的江和副教授鑒定為唇形科(Labiatae)植物黃芩根，60℃干燥，粉碎過80目篩備用；蘆丁標準品購于上海金穗生物科技有限公司(批號20121102)；乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉均為分析純試劑。

1.2 儀器

瑞利UV-2100型雙光束紫外-可見分光光度計(北京北分瑞利分析儀器公司)；BT-2245型電子分析天平(賽多利斯科學儀器北京有限公司)；超聲波細胞粉碎機(寧波新芝生物科技股份有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1最大吸收波長掃描和蘆丁標準曲線制作 精確稱取經(jīng)120℃干燥至恒重的蘆丁標準品10.0mg于50 mL容量瓶，加乙醇適量使其溶解，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，配制成 0.20mg/mL的蘆丁標準溶液。

精確量取2 mL標準品，按如下標準曲線的測定方法用UV-2100型雙光束紫外-可見分光光度計在400～700 nm進行波長掃描以確定最大吸收波長。

分別精密量取0、1、2、3、4、5 mL蘆丁標準品于25 mL容量瓶，加 5 %亞硝酸鈉溶液 1.0 mL，搖勻，放置 6 min，加 10 %硝酸鋁溶液 1.0 mL，搖勻，放置 6 min，加4%氫氧化鈉溶液 5.0 mL，再加水定容至刻度，搖勻，放置 15 min。在最大吸收波長處測定吸光度，以濃度C和吸光度A進行線性回歸，繪制標準曲線。

1.3.2黃芩總黃酮得率的計算 精密稱取1 g黃芩樣品，按實驗設(shè)計好的條件進行超聲提取，采用Al(NO3)3-NaNO2顯色法，根據(jù)標準曲線，由吸光度A計算黃酮質(zhì)量濃度C，則黃芩總黃酮得率Y計算公式為：Y=C×N×V×10-6/m。

C：黃酮質(zhì)量濃度ug/mL

V：濾液體積 mL

m：樣品質(zhì)量g

N：稀釋倍數(shù)

1.3.3方法學考察 按照1.3.2方法，對于實驗采用的Al(NO3)3-NaNO2顯色法測定黃芩總黃酮分別進行精密度實驗、穩(wěn)定性實驗、回收率實驗對實驗方法進行考察，并對超聲提取工藝進行重復性考察。

1.3.4單因素實驗 按照1.3.2方法，其他條件不變，分別考察乙醇濃度、液固比、提取時間對總黃酮得率的影響。

1.3.5響應(yīng)面法優(yōu)化實驗 在方法學考察和單因素實驗的基礎(chǔ)上，以乙醇濃度、液固比、提取時間3個因素為考察因子，總黃酮得率Y為響應(yīng)值用Design-expert軟件設(shè)計3因素3水平(共17個試驗點、5個中心點)的響應(yīng)面實驗，利用響應(yīng)面結(jié)果確定黃芩總黃酮超聲提取最佳工藝。

2 結(jié)果

2.1蘆丁標準品的最大吸收波長與標準曲線

用UV-2100型雙光束紫外-可見分光光度計在400 ～700 nm進行波長掃描，得出最大吸收波長為508.8 nm。在508.8 nm波長下測得蘆丁線性回歸方程為：A=0.0050+0.0106C (r2=0.9994)，蘆丁標準曲線線性關(guān)系良好(見圖1)。

圖1 蘆丁標準曲線

2.2 方法學考察

2.2.1 精密度實驗結(jié)果 精密稱取樣品1 g，按1.3.2方法提取，準確吸取6份續(xù)濾液于6個50 mL容量瓶，依次測定吸光度，計算相對標準偏差(RSD)。得出同一樣品的吸光值的RSD為0.103%，表明其精密度良好，見表1。

表1 精密度實驗

2.2.2穩(wěn)定性實驗結(jié)果 精密稱取樣品1 g，按1.3.2方法提取，分別在0 h、0.5 h、1 h、1.5 h、2 h測定吸光度。由圖2知樣品液顯色后，在2 h內(nèi)，吸光度變化很小，說明黃芩總黃酮與鋁鹽形成的絡(luò)合物顯色穩(wěn)定性好。

圖2 穩(wěn)定性實驗

2.2.3回收率實驗 稱取6份約1 g重樣品，按1.3.2方法提取，分別吸取1 mL濾液于25 mL容量瓶，分別測定其吸光度，其后另取6份濾液各加入5 mL蘆丁標準溶液，依次測定吸光度，計算回收率。由表2知平均回收率為99.83%，說明Al(NO3)3-NaNO2顯色法測定黃芩中黃酮類化合物準確度較高。

表2 回收率實驗

2.2.4重復性提取黃酮實驗結(jié)果 準確稱取1g的樣品4份，在相同條件下提取，按1.3.2方法提取，依次測定吸光度，計算相對標準偏差(RSD)。由表3知四次測得的吸光值RSD為0.171%，表明采用超聲提取黃芩總黃酮重復性好。

表3 重復性實驗

2.3單因素實驗結(jié)果

2.3.1乙醇濃度對黃芩總黃酮得率的影響 在液固比為30 mL/g，提取時間為30 min的條件下，當乙醇濃度<60%時，黃酮得率隨著乙醇濃度的增加而增大；當乙醇濃度為60%時，總黃酮得率最大；超過60%，得率反而下降，見圖3。

圖3 乙醇濃度對總黃酮得率的影響

2.3.2液固比對黃芩總黃酮得率的影響 在乙醇濃度為70%，提取時間為30 min時，隨著液固比的增加，黃酮得率逐漸升高，當達到 40 mL/g 時，黃酮得率達到最大，再增加液料比，黃酮得率下降，見圖4。

圖4 液固比對總黃酮得率的影響

2.3.3提取時間對黃酮得率的影響 在乙醇濃度為70%，液固比為30 mL/g時，提取時間在 10 min 到 40 min 內(nèi)，總黃酮得率呈上升趨勢，然后隨時間的延長逐漸下降(見圖5)。

圖5 提取時間對黃酮得率的影響

2.4 采用響應(yīng)面法對黃芩總黃酮超聲提取工藝的優(yōu)化

2.4.1響應(yīng)面分析因素與水平的選取 根據(jù)Box-Behnken 實驗設(shè)計原理，選取乙醇濃度A、液固比B、提取時間C為影響總黃酮得率的因素，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法，試驗因素及水平設(shè)計(見表4)。

表4 響應(yīng)面法的因素和水平

2.4.2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果 根據(jù)實驗方案進行試驗，利用 Design-Expert 軟件進行數(shù)據(jù)擬合，建立數(shù)學模型，響應(yīng)面分析試驗設(shè)計方案及結(jié)果，詳見表5。

表5 響應(yīng)面方案及實驗結(jié)果

2.4.3模型的建立及其顯著性檢驗 將得出的數(shù)據(jù)進行多項擬合回歸，得到黃芩總黃酮得率Y與乙醇濃度A、液固比B、提取時間C的二次多項回歸方程為：Y=1.74+0.10A-5.625E-0.03B+0.087C+0.075AB+0.074AC+0.017BC-0.24A2-0.037B2-0.13C2。

結(jié)合表6分析該模型知：模型失擬項(P=0.5741) 不顯著，說明實驗誤差是影響回歸方程失擬平方和的主要原因。方程的模型值p<0.000 1達極其顯著水平，表明該模型用于評價實驗結(jié)果的可信度高；Adeq Precision 測得值為20.523，說明模型分辨力高；變異系數(shù)低于10%，說明實驗的穩(wěn)定性良好。綜合以上結(jié)果充分說明可以使用此模型來分析和預測超聲波提取黃芩總黃酮的工藝。另外，一次項A、B的回歸系數(shù)極其顯著，即乙醇濃度和提取時間對總黃酮得率有極其顯著的影響，交互項AB和AC的偏回歸系數(shù)顯著，說明乙醇濃度、液固比、提取時間的交互作用對總黃酮得率有顯著影響。

表6 回歸模型方差分析

2.4.4響應(yīng)曲面結(jié)果 通過Design-Expert軟件得出各影響因素及其交互作用的響應(yīng)曲面和等高線圖，根據(jù)響應(yīng)曲面和等高線的性質(zhì)分析所有相關(guān)圖形，并結(jié)合多項擬合回歸方程得知乙醇濃度與液固比，乙醇濃度和提取時間之間存在明顯的交互效應(yīng)，其他因素之間交互效應(yīng)不明顯。交互作用明顯的兩個響應(yīng)曲面和等高線，見圖6和圖7。

圖6 乙醇濃度和液固比交互作用對總黃酮得率影響的響應(yīng)曲面和等高線圖

圖7 乙醇濃度與提取時間及其交互作用對總黃酮得率影響的響應(yīng)曲面和等高線圖

2.4.5提取工藝條件的確定及可靠性驗證 通過 Design-Expert 軟件求得黃芩總黃酮提取的最佳工藝條件如下; 乙醇濃度為63.33%、液固比43.65 mL/g、提取時間為44.41 min在此預測工藝條件下，黃芩總黃酮得率理論值為 1.776%。

為了保證實驗結(jié)果的準確信，本實驗做了3組平行實驗來驗證響應(yīng)結(jié)果的可信度，同時考慮到實際操作的簡便和節(jié)約資源，將驗證實驗的提取條件設(shè)為; 乙醇濃度為 60%，液固比40 mL/g，提取時間為 45 min，經(jīng)過3 次重復驗證性實驗，計算出黃芩總黃酮平均得率為 1.704%，與理論值較接近，進一步說明利用響應(yīng)面分析法優(yōu)化黃芩總黃酮得出的提取工藝參數(shù)準確、可靠，可應(yīng)用于實際生產(chǎn)操作。

3 討論

超聲波輔助法提取植物總黃酮是目前常用的方法，研究其對各種植物黃酮的最佳提取工藝具有重要的現(xiàn)實意義。為了得到客觀的總黃酮得率數(shù)據(jù)，首先應(yīng)通過方法學考察對實驗室的檢測系統(tǒng)進行評價。本研究采用Al(NO3)3-NaNO2顯色法測定黃芩總黃酮，方法學考察結(jié)果顯示：精密度實驗的RSD為0.103%，回收實驗的平均回收率為99.83%，2 h內(nèi)顯色穩(wěn)定。這些充分說明本實驗室檢測系統(tǒng)對Al(NO3)3-NaNO2顯色法測定黃芩總黃酮的精密度及準確度較高，可用于測定黃芩總黃酮進而計算黃酮得率，為下一步的研究打下基礎(chǔ)。此外本實驗還考察了超聲波輔助法提取黃芩總黃酮的重復性，取4份相同的標本進行提取，結(jié)果顯示4次提取總黃酮得率差別較小，其RSD為0.171%，說明超聲波輔助法提取黃芩總黃酮重復性較好，有利于單因素的研究。

在單因素研究過程中發(fā)現(xiàn)，總黃酮得率隨著乙醇濃度的增大而呈上升趨勢，當乙醇濃度接近60%時，得率最大。根據(jù)極性相似相溶原理，提取物與一定濃度溶劑相互混溶時，生物堿從植物細胞中溶出率高，即只有保證合適的乙醇濃度，才能有利于植物總黃酮從植物中高效析出。另外，溶液中適當水的存在會使植物材料吸水而膨脹，增大了植物細胞和溶液的接觸面積，可以加快傳質(zhì)過程[10]。乙醇體積分數(shù)超過 60% 后，乙醇溶液極性減弱，導致對黃酮類化合物的溶解度相對減小，可能是因為一些弱極性的物質(zhì)、醇溶性雜質(zhì)、植物色素等大量雜質(zhì)溶出，不利于黃酮類物質(zhì)的溶出。通過響應(yīng)曲面發(fā)現(xiàn)：總黃酮得率隨著乙醇濃度和提取時間的增大而增大，兩者交互作用效果顯著；當乙醇濃度在一定的范圍內(nèi)，隨著提取時間的延長有利于黃酮的充分擴散和析出。因此，適當延長提取時間有助于提高黃酮得率，但時間過長有可能導致黃酮的部分分解與轉(zhuǎn)化使得率下降。

以往通常采用正交實驗研究提取生物活性物的最佳工藝，但正交設(shè)計只能處理離散的水平值，而無法找出整個區(qū)域上因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值[9]，響應(yīng)面法克服了上述的缺陷，應(yīng)用此分析方法研究總黃酮提取工藝條件，求得的回歸方程具有較高的精確度，可很好地找到整個區(qū)域上各個因素的最佳組合和響應(yīng)值的最優(yōu)值，是比較理想的方法，也是近年來研究熱點。 本研究采用超聲提取法結(jié)合響應(yīng)面分析法優(yōu)化提取條件是一種新型有效的設(shè)計方法，它綜合了超聲提取和響應(yīng)面法的優(yōu)點，能準確、快速地得出提取工藝參數(shù)。有效降低了中藥提取生物堿工藝條件的復雜程度、減少了實際工藝操作中存在的盲目性。本實驗通過響應(yīng)面圖直觀分析了各因素對黃芩總黃酮提取率的影響，以及因素之間的交互影響作用。得出最佳提取工藝為：乙醇濃度60%，液固比40 mL/g，提取時間45 min。

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(責任編輯胡安娜)

Study on Optimization of the Extraction Techniques of the Total Flavonoids from Scutellariae baicalensis Using Response Surface Methodology

ZHONG Jinbao1，WANG Lili2，WANG Yiyu1

XIE Ronghui3，YIN Changchang2

(1.Undergraduate School of Basic Medicine of JiuJiang University，JiuJiang, Jiangxi 332000，China；

2.School of Basic Medicine of Jiujiang University，JiuJiang, Jiangxi 332000，China；

3. Nanchang University Graduate School of Medicine，Nanchang, Jiangxi 330006，China)

ObjectiveOptimizing the ultrasonic extraction techniques of the total flavonoids from Scutellariae baicalensis，to provide a reference for industrial total flavonoids extraction of Scutellariae baicalensis.MethodUsing the ultrasonic method to extract total flavonoids in Scutellariae baicalensis; investigating the methodology of total flavonoids Scutellariae baicalensis measured by Al(NO3)3-NaNO2reaction；ethanol concentration, liquid-solid ratio and extracting time selected in Box-Benhnken central composite design；optimizing extraction process parameters by using the response surface method (RSM).ResultThe methodological evaluation showed that it was reliable to measure the total flavonoids by Al(NO3)3-NaNO2reaction and the ultrasonic extraction technology in this laboratory；The optimum technical condition in extracting total flavonoids of Scutellariae baicalensis; ethanol concentration 60%, liquid-solid ratio 40 mL/g，extraction time 45 minutes. The predictive value was 1.776% and the yield of the total flavonoids was actually 1.704%，and both results were in good agreement.ConclusionBox-Benhnken design combined with response surface method was convenient and reliable for extracting total flavonoids from Scutellariae baicalensis. The optimal extraction parameters was of reliability and practicality.

scutellariae baicalensis, total flavonoids, response surface analysis(RSA), extraction

國家自然科學基金計劃項目(編號81160536)成果之一。

2014-5-26

殷嫦嫦，博士，教授，南昌大學碩士生導師，研究方向為分子生物學與臨床生物化學。E-mail：yinchangchang112@163.com

R 284.2

A

1674-9545(2014)03-0069-(06)