趙美麗，屈文峰，邊風(fēng)根，徐曉安

(1.江西省化學(xué)工業(yè)學(xué)校，330012，南昌；2.江西昌九生化農(nóng)科化工有限公司，330012，南昌)

白腐菌產(chǎn)漆酶的發(fā)酵條件研究

趙美麗1，屈文峰2，邊風(fēng)根1，徐曉安1

(1.江西省化學(xué)工業(yè)學(xué)校，330012，南昌；2.江西昌九生化農(nóng)科化工有限公司，330012，南昌)

漆酶(E.C.1.10.3.2)是一類含銅的氧化還原酶，其可以催化對(duì)苯二酚(也叫氫醌)氧化生成對(duì)苯醌，也常被稱為對(duì)苯二酚氧化酶。漆酶一般存在于真菌和植物中，由于具有較高的穩(wěn)定性和較好的底物專一性，在印染和環(huán)境有機(jī)毒性化合物的降解、專用生物傳感器的構(gòu)建、以及造紙領(lǐng)域有機(jī)廢棄物的生物加工利用等方面具有實(shí)際工業(yè)應(yīng)用?？疾炝税赘呐囵B(yǎng)和產(chǎn)漆酶條件，對(duì)白腐菌產(chǎn)漆酶的培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)選。結(jié)果顯示，以小麥皮為碳源，硫酸銨和尿素為氮源，白腐菌生長(zhǎng)產(chǎn)酶的適宜培養(yǎng)溫度為28 ℃，pH值為3.5～6.0，培養(yǎng)基的C/N比以20合適。當(dāng)培養(yǎng)基中添加一定的木質(zhì)素沉淀物和葡萄糖時(shí)對(duì)白腐菌液體發(fā)酵產(chǎn)漆酶具有明顯的促進(jìn)作用，菌體發(fā)酵液中加入10 g/L的葡萄糖、6 g/L木質(zhì)素時(shí)發(fā)酵產(chǎn)漆酶的活力達(dá)到最大值。

白腐菌；漆酶；C/N比；酶活

0 引言

漆酶(E.C.1.10.3.2)是一類含銅的氧化還原酶，能催化對(duì)苯二酚(也叫氫醌)氧化生成對(duì)苯醌[1]，因此常被稱為對(duì)苯二酚的氧化酶。漆酶一般存在于真菌和植物中，由于有較高的穩(wěn)定性和較為廣泛的底物專一性，在環(huán)境和印染有機(jī)有毒化合物的降解、生物傳感器的構(gòu)建、造紙業(yè)廢液的處理和綜合加工利用等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用[2]。尤其對(duì)于酚類污染物的處理，作為生物催化劑的真菌漆酶應(yīng)用前景非常好。

目前漆酶生產(chǎn)主要采用微生物發(fā)酵法，工藝方法有固體培養(yǎng)和液體發(fā)酵2種方式[3-6]。本實(shí)驗(yàn)采用液體發(fā)酵方式，探討培養(yǎng)基組成和發(fā)酵條件對(duì)白腐菌生長(zhǎng)和漆酶生產(chǎn)的影響。

1 材料和方法

1.1菌種

白腐菌(whiterotfungNS8)，南昌大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院保藏。

1.2培養(yǎng)基

1.2.1 CPDA培養(yǎng)基(綜合培養(yǎng)基) 馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，磷酸二氫鉀3 g，硫酸鎂1.5 g，維生素B 110 mg，瓊脂18～20 g，自來(lái)水1 000 mL，pH5～6。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基(L) 可溶性的淀粉80.0 g，吐溫6.0 g，愈創(chuàng)木酚20 mmol，氯化銨20.0 g，KH2PO48.0 g，MgSO4·7H2O 2.0 g，CaCl2·2H2O 4.0 g，VB10.016 g，含微量元素的溶液160 mL，pH為自然。

1.3培養(yǎng)發(fā)酵

1.3.1 菌種的培養(yǎng) 在裝有50 mL液體種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，放入適量直徑為5 mm的左右的玻璃珠微粒，滅菌后接入白腐菌斜面菌絲體。在180 r/min，30 ℃，恒溫，振蕩培養(yǎng)4 d，制成液體種子液。

1.3.2 搖瓶發(fā)酵產(chǎn)酶 在250 mL搖瓶中裝入液體發(fā)酵培養(yǎng)基50 mL，滅菌后接入液體菌種(按體積比為10%)，振蕩培養(yǎng)7.5 d。發(fā)酵液于4 800 r/min下離心25 min，取其中的上層清液即為粗酶液。

1.4漆酶活力的測(cè)定

酶活測(cè)定方法—分光光度法。目前國(guó)際上比較常用的測(cè)定漆酶的酶活的方法是以ABTS為底物來(lái)測(cè)定，主要是基于：1)ABTS容易溶解于水中，穩(wěn)定性好，可以在常溫下放置半年；2)測(cè)定的反應(yīng)過(guò)程非常簡(jiǎn)單，只要ABTS反應(yīng)后生成陽(yáng)離子自由基[7]，這種陽(yáng)離子自由基能在水溶液中較穩(wěn)定地存在幾小時(shí)甚至幾天，并且有明顯的綠色便于測(cè)定；3)和漆酶共存時(shí)，ABTS的綠色溶液的摩爾吸光系數(shù)較高，可以保證測(cè)定酶活時(shí)具有較大的靈敏度； 4)ABTS在使用中沒(méi)有任何的毒副作用[8]。

采用分光光度法測(cè)定酶活時(shí)，酶活的單位以3種方式來(lái)定義：1)每分鐘所氧化的底物為1 mmol[9]；2)每分鐘所氧化的底物為1 μmol[10]；3)每分鐘吸光度的值發(fā)生0.001的改變[11]。其中2是定義酶活單位中用得最多的方法，本實(shí)驗(yàn)采用的是第2種方法。在測(cè)定漆酶的活力時(shí)，根據(jù)每分鐘所氧化的底物的1 μmol定義酶活。

計(jì)算漆酶的酶活公式為：

式中：B為酶活值；V總，V酶為反應(yīng)體系中總體積和反應(yīng)中酶液體積；ε為吸光系數(shù)。

漆酶的活力的定義：在一定條件下，每分鐘催化1 μmol的產(chǎn)物生成所需要的酶定義為1單位。

選用漆酶底物為ABTS，總反應(yīng)混合物為6 mL，其中粗漆酶液200 μL，40 μmol/L ABTS及6 mL緩沖液(pH6.5)，反應(yīng)時(shí)間為15 min，反應(yīng)溫度30 ℃。取含酶液0.1 mL，加入HAc-NaAc(pH4.6)緩沖液3 mL，混勻，加入ABTS 0.4 mL，放置30 s，每15 s讀取1次420 nm下吸光值，共讀取6個(gè)數(shù)值。根據(jù)數(shù)據(jù)判斷，如果吸光度的值增長(zhǎng)迅速，則將酶液稀釋2～5倍再次測(cè)定，直至吸光度數(shù)值變化不大，并且吸光度的值在0.2～0.8之間。

酶活的計(jì)算：吸光度變化的斜率×4 000×稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1C/N比對(duì)產(chǎn)漆酶的影響

C/N比是產(chǎn)酶過(guò)程中培養(yǎng)基的重要影響因素，通過(guò)實(shí)驗(yàn)尋找最佳的C/N比。本實(shí)驗(yàn)以小麥皮做碳源，改變初始培養(yǎng)基中的氮源(尿素和硫酸銨)用量，分析不同C/N比對(duì)白腐菌產(chǎn)漆酶的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1。

從表1可知，C/N比在逐漸增大的過(guò)程中，漆酶的活力表現(xiàn)為先上升后下降。當(dāng)C/N比為20時(shí)，漆酶的活力和產(chǎn)率均達(dá)到最高，分別為4 391.9IU/mL和639.5 IU/mL·d。

2.2pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

在產(chǎn)酶過(guò)程中，pH值的大小可以影響的方面較多，如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的狀態(tài)、菌體細(xì)胞膜的穩(wěn)定性及細(xì)胞膜對(duì)所需物質(zhì)的吸收能力等方面。本實(shí)驗(yàn)在pH為2.0～8.0范圍內(nèi)取若干點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

表1 C/N對(duì)產(chǎn)漆酶的影響

分別配制pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基。接種后培養(yǎng)，分析結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，在pH值大于7時(shí)，生產(chǎn)漆酶的活力很低，當(dāng)培養(yǎng)基的pH值控制在3.5～6.0時(shí)，生產(chǎn)漆酶的活力較高。為了操作簡(jiǎn)便和對(duì)細(xì)菌污染的抑制，底物溶液以略偏酸為宜，選擇初始pH值為4時(shí)，漆酶分泌能力較強(qiáng)。

圖1 pH值對(duì)產(chǎn)酶的影響

2.3培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)酶的影響

環(huán)境溫度也是影響真菌產(chǎn)酶的因素，如果溫度太高或太低，都不利于酶的生產(chǎn)。檢測(cè)白腐菌產(chǎn)酶最適溫度在25～40 ℃溫度范圍內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，用標(biāo)準(zhǔn)方法測(cè)定酶活。實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。從圖2看出在不同溫度下液體發(fā)酵產(chǎn)酶的活力有明顯差異。在30 ℃條件下，漆酶的活力在培養(yǎng)第9天時(shí)達(dá)到4 480.8 IU/mL。當(dāng)溫度控制在28 ℃，在第9天時(shí)漆酶的活力達(dá)到4 838.3 IU/mL。

從圖2中可以看出，最佳的培養(yǎng)溫度為28 ℃。溫度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響漆酶的分泌。產(chǎn)酶過(guò)程中最高峰出現(xiàn)在第9天，然后下降。這種現(xiàn)象可能因?yàn)樵谂囵B(yǎng)初期，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌種的數(shù)量不斷增多，漆酶產(chǎn)量也跟著不斷提高，在第9天時(shí)分泌漆酶的量達(dá)到最大；但培養(yǎng)時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)卻逐漸缺少，菌種的代謝能力下降，使得漆酶的產(chǎn)出能力下降。

圖2 培養(yǎng)溫度對(duì)白腐菌分泌漆酶的影響

2.4底物對(duì)白腐菌產(chǎn)漆酶的影響

2.4.1 木質(zhì)素沉淀物的用量對(duì)白腐菌產(chǎn)漆酶的影響 木質(zhì)素是一種漆酶的天然底物，利用木質(zhì)素沉淀物作為底物進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶，正好可以廢物利用、治理環(huán)境污染，而且直接降低漆酶的生產(chǎn)成本。

在搖瓶發(fā)酵液中分別添加不同量的木質(zhì)素沉淀物發(fā)酵生產(chǎn)漆酶，7 d后檢測(cè)酶活力，實(shí)驗(yàn)的結(jié)果如表2所示，可以看出添加木質(zhì)素沉淀物對(duì)白腐菌產(chǎn)酶有一定的促進(jìn)作用。在一定的濃度下，漆酶的活力隨著木質(zhì)素沉淀物量的增加逐漸升高。當(dāng)木質(zhì)素沉淀物的添加量為6 g/L時(shí)，生產(chǎn)漆酶的酶活達(dá)7 055.3 IU/mL，比沒(méi)有添加木質(zhì)素沉淀物的發(fā)酵產(chǎn)酶活力提高5.0倍。再增加木質(zhì)素沉淀物的量，發(fā)酵產(chǎn)酶的酶活的變化不大。

表2 木質(zhì)素用量對(duì)白腐菌產(chǎn)酶的影響

2.4.2 葡萄糖的用量對(duì)白腐菌漆酶產(chǎn)量的影響 由于木質(zhì)素是一種高分子的化合物，一般的微生物是不能直接利用的，所以常常會(huì)在培養(yǎng)基中加入適量的葡萄糖，這樣能促進(jìn)早期菌絲體的生長(zhǎng)，使得漆酶的產(chǎn)量能在發(fā)酵的后期得到明顯提高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出，當(dāng)發(fā)酵液含有木質(zhì)素沉淀物的量為6 g/L，葡萄糖的添加量在10 g/L比較適合。如果加入的葡萄糖的量不足時(shí)，菌絲體生長(zhǎng)緩慢而導(dǎo)致它在后期產(chǎn)出酶的酶活偏低，但加入過(guò)量的葡萄糖，會(huì)使菌絲體早期過(guò)度的生長(zhǎng),對(duì)后期漆酶的合成也不利。

圖3 葡萄糖用量對(duì)白腐菌產(chǎn)酶的影響

3 結(jié)論

以小麥皮為白腐菌產(chǎn)漆酶的碳源，硫酸銨和尿素為氮源，比較合適的C/N比是20。白腐菌發(fā)酵生產(chǎn)漆酶的適宜培養(yǎng)溫度為28 ℃，pH值為3.5～6.0。發(fā)酵液培養(yǎng)基添加木質(zhì)素沉淀物和葡萄糖對(duì)白腐菌發(fā)酵產(chǎn)漆酶具有明顯的促進(jìn)作用，當(dāng)木質(zhì)素加量為6 g/L，葡萄糖添加量為10 g/L時(shí)，白腐菌液體發(fā)酵的菌體生長(zhǎng)和發(fā)酵液中漆酶的產(chǎn)量得到明顯提高。

[1]Givaudan A,Effosse A,Faure D,etal.Polyphenol oxidase inAzospirillumlipoferumisolated from rice rhizosphere:evidence for laccase activity in non-motile strains ofAzospirillumlipoferum[J].FEMS Microbiology Letters,1993,108(2):205-210.

[2]Leontievsky A A,Vares T,Lankinen P,etal.Blue and yellow laccases of ligninolytic fungi[J].FEMS Microbiology Letters,1997,156:9-14.

[3]季立才,胡培植.漆酶的結(jié)構(gòu)、功能及其應(yīng)用[J].氨基酸和生物資源,1996,18(1):25-29.

[4]繆靜,姜竹茂.漆酶的最新研究進(jìn)展[J].煙臺(tái)師范學(xué)院學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2001,17(2):146-150.

[5]周易勇.漆酶的分布[J].中國(guó)生漆,1992,11(3):26-27.

[6]許穎,蘭進(jìn).真菌漆酶研究進(jìn)展[J].食用菌學(xué)報(bào),2005,2(1):57-64.

[7]張敏,肖亞中,龔為民.真菌漆酶的結(jié)構(gòu)和功能[J].生物學(xué)雜志,2003,20(5):6-8.

[8]季立才.漆酶中銅的研究[J].中國(guó)生漆,1990,9(4):22-30.

[9]Sebastien M,Sylvie A,Bemard L,etal.Differential regulation by Ambient pH of putative virulence factor secretion by the phytopathogenic fungusBotrytiscinerea[J].FEMS Microbiology Ecology,2003,43:359-366.

[10]Rancano G,Lorenzo M,Molares N,etal.Production of laccase byTrametesversicolorin an airlift fermentor[J].Process Biochemistry,2003,39(4):467-473.

[11]張敏,肖亞中,蒲春雷.白腐真菌AH28-2菌株發(fā)酵合成漆酶初步研究[J].微生物學(xué)通報(bào),2002,17(3):37-42.

FermantationConditionsofWhiteRotFungiforLaccaseProducing

ZHAO Meili1,QU Wenfeng2,BIAN Fenggen1,XU Xiaoan1

(1.Jiangxi Chemical Industry School,330012,Nanchang,PRC;2.Nine Chang Jiangxi Agricultural Chemical Co.,Ltd.,330012,Nanchang,PRC)

Laccase (E.C.1.10.3.2) is a kind of containing copper oxidoreductase,it could to catalyze hydroquinone oxidation,also be known as hydroquinone oxidase.Laccase exists generally in fungi and plants.Because it has high stability and broad substrate specificity,so be used widely in the toxicant degradation,biosensors, and paper industry.The white rot fungi culture and laccase producing condition had been investigated.The experiment result showed that the wheat skins and ammonium sulfate/urea were the appropriate carbon source and nitrogen source respectively for white rot fungi growth and laccase produced.The optimum conditions were as following:the C/N=20,culture temperature 28 ℃ and pH 3.5～6.Addition of lignin precipitate and glucose has obvious effect on white rot fungi laccase production in liquid fermentation.when the lignin precipitate content reached 6 g/L and glucose 10 g/L in fermentation broth,the laccase activity produced reached maximum.

white rot fungi;laccase;C/N;enzyme activity

2014-06-06;

2014-08-06

趙美麗(1973-)，女，江西永修人，碩士，主要從事儀器分析及食品分析工作。

10.13990/j.issn1001-3679.2014.04.025

TQ925

A

1001-3679(2014)04-0527-04