胡松 陽諾 陳銘伍 郭建極 冼磊

肺癌是臨床常見惡性腫瘤，并且有著最高的癌癥相關(guān)死亡率[1]。非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是最常見的肺癌類型，約占到了肺癌的85%[2]。由于75%的肺癌患者在確診時已經(jīng)有局部或者遠處轉(zhuǎn)移，因此肺癌患者總的5年生存率非常低[3]。對肺癌發(fā)生的可能分子機制研究有限，是肺癌早期診斷率低和患者預(yù)后不良的重要原因之一。

抑癌基因的失活會導(dǎo)致腫瘤的形成和惡性轉(zhuǎn)化。目前，許多研究[4-10]表明，抑癌基因的失活在肺癌的發(fā)生發(fā)展中扮演著重要角色。轉(zhuǎn)錄因子21（transcription factor 21,TCF21）是一個新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，它在多種腫瘤中因存在啟動子區(qū)甲基化，而導(dǎo)致TCF21在癌組織中的表達較癌旁組織降低[11-13]。前期研究[14]表明TCF21在肺癌中低表達，這與其啟動子區(qū)甲基化程度升高有關(guān)。而這種表達降低對肺癌的發(fā)生發(fā)展有何意義，目前尚無相關(guān)報道。

慢病毒載體可以整合、攜帶目的基因，并侵染靶細胞，利用這一技術(shù)可以在靶細胞中大量表達目的基因。使用攜帶有綠色熒光蛋白基因的慢病毒轉(zhuǎn)染細胞，可以通過觀察綠色熒光蛋白的表達來初步判斷慢病毒轉(zhuǎn)染細胞的轉(zhuǎn)染效率?；诒菊n題組前期組織水平的研究結(jié)果，本研究從細胞水平探索TCF21的生物學功能。利用慢病毒轉(zhuǎn)染技術(shù)在肺癌細胞A549中高表達TCF21，用熒光定量PCR和Western blot技術(shù)檢測TCF21基因的mRNA和蛋白的表達水平。在確定高表達成功后，利用MTT實驗、Transwell、流式細胞術(shù)檢測TCF21過表達對肺癌細胞增殖、遷移、凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 人肺癌細胞A549購自中科院上海細胞庫，用含10%胎牛血清，1%的青霉素鏈霉素的1640培養(yǎng)基，于37oC、5% CO2條件下培養(yǎng)。

1.2 慢病毒轉(zhuǎn)染 過表達慢病毒載體由Invitrogen公司合成并構(gòu)建。細胞分為三組：第一組為轉(zhuǎn)染Lenti-TCF21組（過表達組），第二組為轉(zhuǎn)染空載體病毒組（空白載體組），第三組為不轉(zhuǎn)染病毒組（未處理組）。轉(zhuǎn)染流程按照Invitrogen公司說明書進行。于轉(zhuǎn)染前8 h將A549細胞按3,000個/孔接種至24孔板，待細胞融合率達到30%-50%時開始轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染MOI值為100，總液體量為500 μL/孔。轉(zhuǎn)染10 h后將液體換為含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在轉(zhuǎn)染后12 h、24 h、36 h、48 h、60 h、72 h、84 h、96 h共8個時點，隨機選取多個視野，分別計數(shù)白光與熒光條件下的可見細胞數(shù)，通過相同視野中熒光條件下可見細胞數(shù)與白光下可見細胞數(shù)之比來計算平均轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染72 h后熒光最強，于此時收獲細胞用于下一步實驗。

1.3 熒光定量PCR 按照RNA提取試劑盒說明書步驟提取細胞總RNA。然后使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用Roche公司的SYBR Green Master Mix進行熒光定量PCR。PCR進行40個循環(huán)，循環(huán)參數(shù)為（94oC 30 s,54.5oC 30 s, 72oC 30 s）。引物如下: TCF21上游20 bp，5'-CC AGCTACATCGCCCACTTG-3'，下游23 bp，5'-CTTTCAGG TCACTCTCGGGTTTC-3'，GAPDH上游20 bp，5'-ACCACA GTCCATGCCATCAC-3'，下游20 bp，5'-TCCACCACCCTG TTGCTGTA-3'。TCF21基因轉(zhuǎn)錄水平按照2-ΔΔCt法通過管家基因GAPDH進行校正。

1.4 Western blot 使用細胞裂解液從各組細胞中提取細胞總蛋白。蛋白樣品用12% SDS-PAGE跑膠后轉(zhuǎn)膜至0.22 μm的PVDF膜上。5%牛奶室溫封閉1 h，4oC孵育TCF21（1:1,000稀釋）和GAPDH（1:5,000稀釋）一抗過夜。兔抗人多克隆抗TCF21抗體購自Abcam公司（Ab32981）。充分洗膜后室溫孵育二抗1 h。再次洗膜后于暗室中顯影、定影。

1.5 MTT 在96孔板中分別轉(zhuǎn)染和處理三組細胞，分別在轉(zhuǎn)染后24 h、48 h、72 h、96 h加入20 μL/孔5 mg/mL的MTT溶液；繼續(xù)37oC溫箱培養(yǎng)4 h，小心吸盡培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜；輕輕振蕩溶解結(jié)晶之后上酶標儀于490 nm處檢測吸光度（A）值，實驗重復(fù)3次，繪制生長曲線。

1.6 遷移實驗 收集轉(zhuǎn)染后72 h的三組細胞并計數(shù)，用1640培養(yǎng)基調(diào)整細胞密度至1×105個/mL。將200 μL細胞懸液接種至Transwell小室的上室，下室添加700 μL含20%胎牛血清的1640培養(yǎng)基。溫箱培養(yǎng)12 h后用棉簽擦去上室表面的細胞。下室表面的細胞使用蘇木素染色2 min。顯微鏡下隨機選取5個視野觀察計數(shù)，計算平均穿膜細胞數(shù)。每組實驗重復(fù)三次。

1.7 流式細胞術(shù) 收集轉(zhuǎn)染后72 h的三組細胞，計數(shù)細胞，每管取5×105個細胞，然后按照凋亡檢測試劑盒說明書步驟操作如下：每管加50 μL Binding Buffer和5 μL 7-AAD的混合液，室溫避光反應(yīng)15 min。依次加入450 μL Binding Buffer和1 μL Annexin V-PE，室溫避光反應(yīng)15 min后上流式細胞儀檢測。每組重復(fù)3次。Apoptosis Detection Kit購自凱基生物有限公司。

1.8 統(tǒng)計學處理 計數(shù)資料兩組間比較使用卡方檢驗。計量資料實驗數(shù)據(jù)以Mean±SD表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Lenti-TCF21成功轉(zhuǎn)染細胞 為了檢測慢病毒轉(zhuǎn)染細胞的轉(zhuǎn)染效率，我們用熒光顯微鏡對轉(zhuǎn)染細胞進觀察計數(shù)。過表達組和空白載體組均見有綠色熒光蛋白表達，且在轉(zhuǎn)染72 h后觀察到熒光強度最強，平均轉(zhuǎn)染效率為85%（圖1）。

2.2 熒光定量PCR檢測TCF21基因mRNA的表達水平 為了檢測TCF21是否過表達成功，我們對轉(zhuǎn)染后72 h的細胞進行了更精確的熒光定量PCR檢測。結(jié)果顯示過表達組TCF21 mRNA表達量遠遠超過未處理組和空白載體組的TCF21 mRNA表達量（2,705.59±231.22 vs 1.00±0.31, 1.43±0.73）（P＜0.05）（圖2A）。

2.3 Western blot檢測TCF21蛋白的表達水平 為進一步檢測TCF21蛋白是否表達成功，我們采用Western blot技術(shù)檢測三組細胞中TCF21蛋白表達量。結(jié)果顯示相對于未處理組，過表達組TCF21表達明顯增高，而空白載體組和未處理組未見明顯TCF21蛋白表達。這與熒光定量PCR的檢測結(jié)果一致，更進一步說明A549細胞中過表達了TCF21蛋白（圖2B）。

2.4 過表達TCF21對A549細胞增殖的影響 對轉(zhuǎn)染后的三組細胞采用MTT法進行了細胞增殖活性實驗。實驗結(jié)果顯示：高表達組與空白載體組和未處理組比較，在24 h的檢測結(jié)果顯示三組間無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。而在48 h、72 h、96 h的檢測結(jié)果顯示實驗組OD值明顯低于空白載體組和未處理組（0.44±0.02 vs 0.52±0.03, 0.54±0.04； 0.80±0.05 vs 1.35±0.06, 1.50±0.05； 1.08±0.08 vs 1.87±0.13, 1.96±0.10）（P＜0.05），而后兩者之間無明顯差異。說明TCF21能夠在48 h以后明顯抑制肺癌細胞A549的增殖（圖2C）。

圖1 TCF21在肺癌細胞A549中的表達Fig 1 The overexpression of TCF21 in A549 lung cancer cells

圖2 TCF21在肺癌細胞A549中的表達及對細胞增殖的影響。A：熒光定量PCR檢測TCF21 mRNA在各組中的表達量；B：Western blot檢測TCF21蛋白在各組中的表達量；C：MTT檢測過表達TCF21對各組細胞增殖的影響。Fig 2 The overexpression of TCF21 in A549 lung cancer cells and its influence on cell proliferation. A: Fluorescence quantitative polymerase chain reaction was used to analyze the expression of TCF21 mRNA； B: Western blot was used to analyze the expression of TCF21 protein； C: Proliferation assay were applied to test the impact of TCF21 expression on the cell proliferation of A549 after transfection.

2.5 過表達TCF21對A549細胞遷移能力的影響 我們對三組細胞進行了Transwell細胞遷移實驗。結(jié)果顯示實驗組細胞遷移率要明顯低于空白載體組和未處理組（24.53±4.92 vs 54.53±8.57, 58.27±9.10）（P＜0.05）（圖3），而后兩者之間無明顯差異。這一結(jié)果說明TCF21的過表達能夠明顯抑制肺癌細胞A549的遷移。

2.6 過表達TCF21對A549凋亡率的影響 在轉(zhuǎn)染后72 h使用流式細胞儀對三組細胞進行了細胞凋亡分析。結(jié)果顯示高表達TCF21蛋白的實驗組較空白載體組和未處理組細胞凋亡率明顯上升（16.93±1.21 vs 1.29±0.32, 0.76±0.39,P＜0.05）且為早期凋亡，而后兩者之間無明顯差異。這一結(jié)果說明TCF21的過表達能夠促進肺癌細胞A549發(fā)生早期凋亡（圖4）。

3 討論

研究[17-21]發(fā)現(xiàn)多種抑癌基因（如p53、PTEN、Rb等）在肺癌等腫瘤中存在缺失、突變或異常低表達等改變，且表達量隨腫瘤惡性程度的增高而降低。TCF21在多種腫瘤中存在啟動子區(qū)甲基化，且其在腫瘤組織中的表達量較非腫瘤組織明顯降低[11-13]。本課題組前期關(guān)于TCF21表達和啟動子區(qū)甲基化的研究也證實了這一結(jié)論[14]。另外有研究[11]顯示TCF21的表達量與患者的低生存率存在明顯相關(guān)性。并且TCF21的甲基化能夠通過患者的血樣檢測出來[13]，提示TCF21可能是一個潛在的腫瘤標記物，并且檢測這種標記物所需的樣品容易獲取，檢測十分方便。

本研究在組織水平的研究基礎(chǔ)上通過體外細胞培養(yǎng)進一步探索TCF21的抑癌功能，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達TCF21能夠顯著抑制肺癌細胞A549生長和引起細胞凋亡率的升高。本研究在前人的基礎(chǔ)上[22]有新的突破，TCF21對肺癌凋亡率的影響也部分解釋了TCF21為什么能夠抑制細胞增殖。同時也從側(cè)面支持了Smith等[22]的結(jié)論。近期有報道[15,16]稱TCF21能夠直接作用于KISS1基因，促使其表達上調(diào)，而KISS1能夠間接地觸發(fā)細胞凋亡[23]。那么TCF21是否是通過KISS1介導(dǎo)而實現(xiàn)促進凋亡的作用，這一猜想尚需實驗證實。另一方面TCF21是一個轉(zhuǎn)錄因子，眾所周知，轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶II形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物，共同參與多種轉(zhuǎn)錄起始的過程[24,25]。那么是否TCF21還參與KISS1以外的其他基因啟動子區(qū)的調(diào)控，從而實現(xiàn)抑癌功能，這需要我們進一步拓展研究。本研究通過肺腺癌細胞株A549來研究TCF21基因的抑癌功能及其機制，問題在于A549不能夠完全代表其他類型的非小細胞肺癌，體外細胞實驗不能夠完全模擬體內(nèi)生理環(huán)境，故實驗存在一定的局限性。對于本研究中TCF21基因過表達引起的增殖抑制和細胞凋亡率增加，為進一步確定其準確性，應(yīng)該進一步檢測細胞增殖和凋亡相關(guān)蛋白的表達量，在我們的后期研究中，我們會進一步完成相關(guān)蛋白的檢測。這也為我們后期研究留下了空間。

圖3 TCF21過表達對肺癌細胞A549遷移能力的影響。A：Transwell檢測三組細胞遷移能力。B：三組細胞的穿膜細胞數(shù)統(tǒng)計圖。Fig 3 The impact of TCF21 overexpression on the cell migration of lung cancer cell A549. A:Transwell were applied to test the impact of TCF21 expression on the cell migration of A549 after transfection. B: Statistical figure of the numbers of cell permeating septum in three groups.

圖4 TCF21過表達對肺癌細胞A549凋亡率的影響。A：流式細胞術(shù)檢測三組細胞凋亡率。B：三組細胞凋亡率統(tǒng)計圖。Fig 4 The impact of TCF21 overexpression on apoptosis rate of lung cancer cell A549. A: Flow cytometry were applied to test the impact of TCF21 expression on the cell apoptosis of A549 after transfection； B: Statistical figure of apoptosis rate in three groups.

本研究的結(jié)果展示了TCF21的抑癌功能，同時也提示我們可以進一步擴展探索TCF21的其他功能，包括TCF21對肺癌細胞放療敏感性的影響，化療敏感性的影響，對裸鼠體內(nèi)成瘤能力的影響。這為我們展示了研究TCF21的巨大潛力。在我們的后期研究中我們將一方面致力于擴展TCF21基因在肺癌細胞中的功能研究，并在裸鼠體內(nèi)做成瘤試驗，以驗證體外細胞實驗的結(jié)論。另一方面致力于探索TCF21抑癌的具體機制，尋找其具體參與的分子調(diào)控機制。為肺癌的早期診斷和分子靶向治療提供依據(jù)。