陳穎 雷玉潔 黃云超 饒鐘鳴 葉聯(lián)華 趙光強 王小燕

在肺癌診療過程中幾乎每位肺癌患者都可能永久或暫時被植入生物材料如：血管導管、外科縫合線、支架、引流管等。肺癌患者自身免疫低下，在接受綜合治療如：手術、化療、放療過程中又加重了自身的免疫功能損傷，易并發(fā)院內(nèi)感染，特別是以生物材料為中心的感染（biomaterial centered infection, BCI），是院內(nèi)感染的高發(fā)人群。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)由于細菌粘附于植入材料表面形成生物膜（biofilm, BF）以及機體免疫功能失調(diào)是造成BCI反復發(fā)作，難以控制的關鍵因素[1]。

BCI多由葡萄球菌屬引起，特別是定植皮膚、粘膜表面條件致病菌表皮葡萄球菌（staphylococcus epidermidis, SE）常伴隨植入過程侵入體內(nèi)[2]。SE粘附于植入材料表面后，其分泌的聚集相關蛋白（accumulation-associated protein, Aap），可促進SE聚集形成BF，是形成細菌生物膜的主要成分。

轉(zhuǎn)換生長因子-β1（transforming growth factor β1,TGF-β1）是惡性細胞分泌的免疫抑制因子之一，是一類功能復雜的細胞因子。由肺癌細胞分泌的TGF-β1不僅與細胞免疫失調(diào)密切相關，而且與肺癌的發(fā)生、發(fā)展以及預后關系密切[3-5]。

本實驗探討TGF-β1與表皮葡萄球菌Aap基因?qū)Ψ伟┗颊哚t(yī)用硅橡膠材料表面生物膜形成的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗用菌種及試劑、器材 表皮葡萄球標準株RP62A（生物膜表型陽性，經(jīng)基因組測序證明存在完整Aap基因），ATCC 12228（生物膜表型陰性，經(jīng)基因組測序證明Aap基因缺失）購自中國科學院微生物研究所；人肺腺癌細胞系A549由云南省腫瘤研究所提供；人轉(zhuǎn)化生長因子β1（PeproTech公司，美國）；淋巴細胞分離液（Sigma公司，美國）；API試紙條（BioMerirux公司，法國）； rTaq DNA Marker（Takara公司，日本）；PCR使用所用引物如表1所示，由大連TaKaRa生物工程有限公司設計，上海生工生物工程有限公司合成。

醫(yī)用硅橡膠（四川大學生物材料系），將硅橡膠材料加工成面積0.5 cm×1.0 cm大小，甲醛熏蒸24 h滅菌備用。RPMI 1640培養(yǎng)基、DMSO、PBS緩沖液（GIBCO公司，美國）；FBS（COSTAR公司，美國）；電子顯微鏡EYO LS10（Carl Zeiss公司德國）；紫外分光光度儀、梯度PCR儀（Bio-Rad公司，美國）。

1.2 臨床表皮葡萄菌的分離、鑒定及細菌DNA的提取

1.2.1 臨床表皮葡萄菌的分離、鑒定 留置胸腔引流管的肺癌患者，在排除導管部位發(fā)炎或化膿及其他原因的急性發(fā)熱、寒顫等全身情況下，拔除導管。將導管頂端3 cm浸于肉湯培養(yǎng)基中，經(jīng)振蕩、超聲洗脫或離心處理后，使用肉湯進行倍比稀釋，種植于血瓊脂平板上。根據(jù)血瓊脂平板上菌落的形態(tài)及革蘭氏染色，API試劑條行種屬鑒定，確認所分離到的細菌為表皮葡萄球菌。

1.2.2 細菌DNA的提取 選取單個葡萄球菌接種于5 mL肉湯培養(yǎng)基37oC震蕩過夜，加入180 μL的TE緩沖液吹勻，加入20 μL 50 mg/mL溶菌酶溶液37oC溫育20 min后，加入15 μL的蛋白酶K混勻，55oC溫育40 min。加入5 μL RNase A震蕩樣品，靜置20 min。加入220 μL BTL緩沖液，混勻后再65oC溫育10 min。將上清轉(zhuǎn)入新管中，500 μL Buffer HB溶液，10,000 g離心1 min。1 mL的70%乙醇洗滌后沉淀，離心棄乙醇，重溶于200 μL TE緩沖液中，準備PCR檢測。

表1 PCR引物、復性溫度及產(chǎn)物長度Tab 1 The PCR primers, annealing temperature and the products lengths

1.2.3 PCR擴增Aap DNA、16s rRNA，檢測臨床表皮葡萄球菌株Aap基因 以表皮葡萄球菌基因組為模板，16s rRNA為內(nèi)參，擴增Aap基因（表1）。PCR反應過程：起始變性: 94oC 3 min；變性: 94oC 30 s；退火（Aap）：58oC 30 s，退火（16s rRNA）: 60oC 30 s；延伸: 72oC 1 min；循環(huán): 第2-4步驟35個循環(huán)；最終延伸: 72oC 10 min。微量加樣槍取DNA 2 μL加入的2%瓊脂糖凝膠板，加入Marker 2 μL，在電泳槽內(nèi)進行100 V電泳20 min，成像儀進行檢測，檢測臨床SE分離株Aap基因表達。

1.3 表皮葡萄球菌Aap基因在醫(yī)用硅橡膠上生物膜形成情況 將臨床分離SE Aap+株38株，SE Aap-株8株，濃度調(diào)整為1×106/mL，與醫(yī)用硅橡膠在24孔板內(nèi)培養(yǎng)30 h，取出硅橡膠材料。PBS液進行沖洗3遍，Bouin固定液進行固定1 h，無菌蒸餾水沖洗3遍。使用結晶紫染色3 min，再次無菌蒸餾水沖洗，晾干在微量酶測量標儀上測定490 nm波長吸光度值，測定每株細菌均值。按上述方法測出空白對照490 nm的均值。用實驗組值減去空白對照組值，差值＞0.12的菌株即可判斷細菌生物膜形成。

1.4 非小細胞肺患者PBMCs分離及A549制備 采集非小細胞肺癌患者外周靜脈血10 mL，使用淋巴細胞分離液，在2,000 r/min，溫度4oC下離心20 min。小心吸出血漿層和淋巴細胞分離液交界的外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）。轉(zhuǎn)移入另一15 mL離心管中加入Hanks液1,000 r/min離心10 min后洗滌3次，使用含10%PBS的RPMI-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)液，置于37oC、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)備用。

復蘇A549細胞株，用含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)液，在37oC、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2天后細胞傳代，加入0.25%胰酶消化，取第3代生長旺盛細胞，制備細胞懸液，調(diào)整濃度為1×106/mL。

1.5 不同濃度TGF-β1下醫(yī)用硅橡膠表面生物膜的形成選取SE Aap+株、SE Aap-株（各6株）以及SE標準株，RP62A、ATCC12228濃度為1×106/mL細菌懸液各1 mL。加入在不同濃度（0 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 40 ng/mL）的TGF-β1因子下，在濃度1×106/mL的A549細胞，濃度為1×106/mL，PBMCs中共培養(yǎng)30 h上清液中1 mL。后與滅菌硅醫(yī)用橡膠（每組兩片）共培養(yǎng)30 h，半定量粘附試驗檢測表皮葡萄球菌細菌生物膜形成的情況方法同前。

SEM標本制作和觀察用羥乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）緩沖液（pH=7）沖洗3次，4%戊二醛固定于SEM載物臺上，PBS沖洗3遍，二氧化碳（CO2）臨界干燥，離子濺射表面固定鍍膜致PVC材料表面成金黃色，掃描電鏡觀察細菌生物膜表面結構。

1.6 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，各組的細胞膜生長情況先進行方差齊性檢驗，若方差齊則采用單因素方差分析進行F檢驗，進一步做兩兩比較使用q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 表皮葡萄球菌臨床分離株Aap基因PCR檢測結果 臨床表皮葡萄球菌分離株46株與標準株RP62A、ATCC1228株，經(jīng)PCR檢測：46株表皮葡萄球菌的16s RNA檢測陽性率為100%。Aap+株共38株，陽性率82.6%，Aap-株共8株，陰性率17.4%（圖1）。

2.2 表葡菌生物膜的形成能力與Aap基因的相關分析 半定量作為判定生物膜形成能力的標準，Aap基因的存在與SE生物膜形成密切相關（P＜0.01）（表2）。

2.3 TGF-β1因子對SE Aap+株細菌生物膜形成的影響 半定量方法測結果：10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL TGF-β1因子刺激下SE986、SE842、SE317、SE276、RP62A細菌生物膜的厚度大于空白對照組（P＜0.05）。通過組間比較q檢驗提示20 ng/mL、40 ng/mL組細菌生物膜的厚度無差異（P＞0.05）（表3）。

2.4 TGF-β1因子對SE Aap-株細菌生物膜形成的影響 通過半定量方法測量結果：10 ng/mL、20 ng/mL、40 ng/mL TGF-β1因子刺激下的各表皮葡萄球菌的厚度與空白對照組未見差異（P＞0.05）。各濃度TGF-β1組間比較未見差異（P＞0.05）。實驗證明SE Aap-在不同濃度TGF-β1因子刺激（0 ng/mL, 10 ng/mL, 20 ng/mL, 40 ng/mL）均不能形成細菌生物膜（表4）。

2.5 SEM觀察不同濃度TGF-β1組醫(yī)用硅橡膠表面細菌生物膜形成情況 SE Aap+株與RP62A株，在（10 ng/mL, 20 ng/mL, 40 ng/mL）TGF-β1組中，可觀察到在醫(yī)用硅橡膠表面大量SE相互聚集重疊，形成生物膜；在對照組中，僅見少量聚集SE粘附與硅橡膠表面，無生物膜形成（圖2）。

SE Aap-株與標準株ATCC12228株，在（10 ng/mL, 20 ng/mL, 40 ng/mL）TGF-β1組及在對照組中，可觀察到在醫(yī)用硅橡膠表面零散分布單個表皮葡萄球菌，未觀察到表皮葡萄球菌出現(xiàn)相互聚集產(chǎn)生細菌生物膜（圖3）。

表2 表皮葡萄球菌Aap基因檢測陽性率與生物膜表型檢測Tab 2 The Staphylococcus epidermidis Aap genetic testing positive rate of biofilm formation detection

表3 不同濃度TGF-β1對A549上清液與外周單個核細胞共同培養(yǎng)下Aap+表葡菌生物膜厚度（Mean±SD）Tab 3 Different concentrations of TGF-β1 on the A549 supernatant and peripheral mononuclear cells co-cultured in the Aap positive SE biofilm thickness (Mean±SD)

表4 不同濃度TGF-β1對A549上清液與外周單個核細胞共同培養(yǎng)下Aap-表葡菌生物膜厚度的作用（Mean±SD）Tab 4 Different concentrations of TGF-β1 on the A549 supernatant and peripheral mononuclear cells co-cultured in the Aap negative SE biofilm thickness (Mean±SD)

圖1 表皮葡萄球菌標準株PCR檢測結果Fig 1 Gel electrophoresis figure of PCR products

圖2 SEM圖片。A：40 ng/mL TGF-β1組SE Aap+株SEM圖片；B: 20 ng/mL TGF-β1組SE Aap+株SEM圖片；C：10 ng/mL TGF-β1組SE Aap+株SEM圖片；D：0 ng/mL TGF-β1組SE Aap+株SEM圖片。Fig 2 SEM pictures. A: The SEM picture of Aap postive SE biofilm in 40 ng/mL TGF-β1 gourp； B: The SEM picture of Aap postive SE biofilm in 20 ng/mL TGF-β1 gourp； C: The SEM picture of Aap postive SE biofilm in 10 ng/mL TGF-β1 gourp； D: The SEM picture of Aap postive SE biofilm in 0 ng/mL TGF-β1 gourp.

圖3 SEM圖片。A：40 ng/mL TGF-β1組SE Aap-株SEM圖片；B：20 ng/mL TGF-β1組SE Aap-株SEM圖片；C：10 ng/mL TGF-β1組SE Aap-株SEM圖片；D：0 ng/mL TGF-β1組SE Aap-株SEM圖片。Fig 3 SEM pictures. A: The SEM picture of Aap negative SE biofilm in 40 ng/mL TGF-β1 group； B: The SEM picture of Aap negative SE biofilm in 20 ng/mL TGF-β1 group； C: The SEM picture of Aap negative SE biofilm in 10 ng/mL TGF-β1 group； D: The SEM picture of Aap negative SE biofilm in 0 ng/mL TGF-β1 group.

3 討論

研究[6,7]表明，肺癌患者的免疫應答以T細胞免疫為主，肺癌細胞產(chǎn)生的免疫抑制因子TGF-β1是造成癌癥患者免疫功能紊亂、Th1/Th2因子失調(diào)、T淋巴細胞與NK細胞活性較低的主要原因之一。肺癌患者接受手術、化療、放療過程中，更易受條件致病菌感染。

肺癌治療過程中所植入的生物材料增加了細菌入侵宿主途徑，降低了機體的防御能力，BCI上升明顯。對于抵抗力較低的癌癥患者來說，一旦發(fā)生BCI，死亡率高達3%-60%，甚至可達到80%。研究[8]表明，BCI與細菌在生物材料表面粘附形成BF密切相關。在TGF-β1因子高表達的肺癌患者，中心靜脈導管相關性血流感染幾率較高，細菌產(chǎn)生BF的比例也升高。定植皮膚表面的條件致病菌SE是植入材料感染的主要條件致病菌，占肺癌患者BCI的40%。

Aap是一種SE細胞壁錨定蛋白，在BF形成的初期可促進細菌相互粘附，是SE生物膜的主要成分之一[9]。Aap結構包括A末端區(qū)域和B重復區(qū)域。A區(qū)域功能在于使SE粘附在人皮膚表面，B區(qū)域可以增強其粘附功能。B重復區(qū)域由5到17個可變數(shù)量的幾乎相同128氨基酸組成的保守半重復末端結構，通過Zn2+-依賴的D二聚體實現(xiàn)細菌間的直接粘附[10,11]。通過Zn2+螯合劑可以抑制SE Aap基因的表達，進而影響細菌生物膜的形成。Aap基因陰性的表皮葡萄球菌M7株，可以粘附在生物材料表面，但是不能在其表面聚集形成生物膜。

醫(yī)用硅橡膠價格低廉、易加工、生物相容性良好是臨床中最常用生物材料之一，廣泛用于制作醫(yī)用導管、引流管及假體植入等。研究臨床分離SE Aap+株與SE Aap-株在醫(yī)用硅橡膠生物膜的形成。結果提示在肺癌患者醫(yī)用硅橡膠引流管植入引起感染中，表皮葡萄球菌Aap基因與細菌生物膜密切相關，臨床分離葡萄球菌Aap-株不能在硅橡膠表面形成細菌生物膜。提示Aap基因是表皮葡萄球菌生物膜形成過程中的重要調(diào)節(jié)基因，調(diào)控細菌聚集相關過程，缺乏Aap基因所調(diào)控的聚集相關蛋白的輔助，表皮葡萄球菌難以在生物材料相互聚集形成細菌群落，最終形成生物膜。

本研究通過分離肺癌患者外周單個核細胞與肺腺癌細胞A549在不同濃度TGF-β1因子刺激下共同培養(yǎng)，模擬體外肺癌免疫抑制狀態(tài)下表皮葡萄球菌臨床分離株在生物材料表面形成過程。結果提示TGF-β1對在肺癌細胞微環(huán)境中SE Aap+生物膜形成有一定促進作用?？赡苁怯捎诜伟┗颊逿淋巴細胞與NK細胞活性以及體內(nèi)非特異性殺傷因子水平較健康人群低下[12]，TGF-β1的加入進一步抑制肺癌患者PBMCs相關細胞因子的分泌，導致對細菌的殺傷作用下降，細菌更易達到粘附在生物材料表面所需數(shù)量。當局部粘附的SE數(shù)量達到一定程度后，由于肺癌患者機體因子失調(diào)，免疫監(jiān)視紊亂，可能導致細菌在生物材料上聚集過程不易引發(fā)免疫細胞吞噬作用[13,14]。最終導致細菌之間相互粘附、分化、增殖，并分泌大量細胞外粘物質(zhì)形成BF。

肺癌患者體內(nèi)免疫因子與TGF-β1作用關系復雜，表皮葡萄球菌細菌生物膜形成的分子學研究不但涉及蛋白依賴，而且還存在多糖依賴等。生物材料植入感染BF形成與生物材料、病原菌、宿主三者的相互關系密不可分。目前國內(nèi)外對于BCI的研究大多數(shù)集中在心血管、口腔、泌尿、整形骨科等學科領域，而對肺癌患者治療中出現(xiàn)的BCI的研究報道不多，如何分別從生物材料、細菌基因水平、宿主三個方面預防肺癌治療中BCI值得進一步研究。