張發(fā)云 秦 蕾 梁 偉

活體自發(fā)光成像監(jiān)測長春瑞濱納米膠束抗乳腺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制研究*

張發(fā)云 秦 蕾 梁 偉

梁偉 教授，博士，現(xiàn)任中科院生物物理研究所研究員，博士生導(dǎo)師。2000年于上海醫(yī)藥工業(yè)研究院獲藥劑學(xué)博士學(xué)位。2000～2004年，先后在美國明尼蘇達(dá)大學(xué)、哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院、東北大學(xué)從事博士后研究工作?，F(xiàn)任蛋白質(zhì)與多肽藥物實(shí)驗(yàn)室副主任、中國生物物理學(xué)會第九屆理事會理事、中國生物物理學(xué)會分子影像學(xué)專業(yè)委員會副主任委員、中國藥學(xué)會藥劑專業(yè)委員會委員、《納米科學(xué)與技術(shù)》叢書編委會編委等職。主要研究藥物新型輸送系統(tǒng)和藥物新靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)。提出并實(shí)現(xiàn)了利用膠束運(yùn)載抗腫瘤藥物到達(dá)實(shí)體瘤內(nèi)部深層細(xì)胞，提高了藥物的療效、降低了毒副作用，為臨床腫瘤治療提供新的策略；發(fā)現(xiàn)組織纖維化為腫瘤細(xì)胞的生成和發(fā)展提供了有利的微環(huán)境,促進(jìn)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，TGF-β/Smad3信號通路在這一過程中起到關(guān)鍵作用并作為藥物篩選的新靶點(diǎn)。主持項(xiàng)目包括國家新藥創(chuàng)制重大專項(xiàng)、科技部973、重大科學(xué)研究計劃等。研究成果入選2007年“中國科技十大進(jìn)展新聞”，獲2008年中國藥學(xué)會科學(xué)技術(shù)獎（二等獎）、2010年第十二屆中國專利優(yōu)秀獎、2012年國家自然科學(xué)獎（二等獎）。授權(quán)發(fā)明專利9項(xiàng)，在JNCI、ACS Nano、Cancer Res等國際重要刊物發(fā)表研究論文40余篇。

目的：乳腺腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是乳腺癌致死的主要原因。淋巴轉(zhuǎn)移作為血道和淋巴兩大轉(zhuǎn)移途徑之一，在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中至關(guān)重要。針對乳腺癌轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，本研究組設(shè)計了具有淋巴富集特性的納米載藥系統(tǒng)，活體動態(tài)監(jiān)測其對原位乳腺腫瘤生長以及肺臟和淋巴器官轉(zhuǎn)移的抑制效果，旨在為臨床用藥提供科學(xué)依據(jù)。方法：采用活體自發(fā)光成像實(shí)時動態(tài)地監(jiān)測了聚乙二醇化磷脂（PEG-PE）包載的長春瑞濱納米膠束抗乳腺癌體內(nèi)轉(zhuǎn)移的過程。結(jié)果：與未包載的游離長春瑞濱（Free Vin）相比，PEG-PE包載的長春瑞濱膠束（NanoVin）增強(qiáng)了長春瑞濱的抗原位瘤活性，顯著抑制了乳腺腫瘤細(xì)胞的淋巴及肺臟轉(zhuǎn)移。結(jié)論：通過靜脈給藥達(dá)到了血道轉(zhuǎn)移和淋巴轉(zhuǎn)移兩條途徑的雙重清掃，為靶向藥物設(shè)計提供了新思路?；铙w光學(xué)成像技術(shù)可動態(tài)監(jiān)測腫瘤的轉(zhuǎn)移，為臨床應(yīng)用影像技術(shù)檢測藥物療效提供必要的技術(shù)手段。

長春瑞濱納米膠束 活體光學(xué)成像 乳腺癌 淋巴轉(zhuǎn)移

腫瘤轉(zhuǎn)移是腫瘤細(xì)胞從原發(fā)部位經(jīng)過一系列步驟到達(dá)宿主遠(yuǎn)端組織或器官后得以繼續(xù)生長，形成與原發(fā)腫瘤相同性質(zhì)的繼發(fā)腫瘤的過程［1］。臨床數(shù)據(jù)表明，90%的腫瘤患者最終死于轉(zhuǎn)移［2］。因此，研究開發(fā)抗腫瘤轉(zhuǎn)移的藥物尤為重要。

淋巴轉(zhuǎn)移和血液轉(zhuǎn)移是腫瘤轉(zhuǎn)移的兩個主要途徑。在乳腺癌等多種實(shí)體瘤中，腫瘤早期通過淋巴轉(zhuǎn)移［3］。在腫瘤晚期，則會發(fā)生血液轉(zhuǎn)移。因此，抑制這兩個途徑的轉(zhuǎn)移十分重要。然而，靜脈注射的納米藥物往往粒徑很大，難以被淋巴攝取。而淋巴靶向給藥可以直接被淋巴系統(tǒng)攝取，但對血液轉(zhuǎn)移抑制作用有限。研究發(fā)現(xiàn)，藥物尺寸大小是影響淋巴攝取和淋巴結(jié)滯留的重要因素之一［4］。粒徑小于10 nm的粒子被優(yōu)先重吸收進(jìn)入毛細(xì)血管，而淋巴攝取粒子的最佳粒徑則在10～30 nm之間。納米膠束載藥系統(tǒng)是近年來興起的一類給藥系統(tǒng)。目前，已有膠束制劑處于研發(fā)和臨床實(shí)驗(yàn)階段，如Genexol-PM、NC-6004、NK911等［5-7］。本實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)，采用嵌段共聚物聚乙二醇化磷脂（PEG2000-PE）包載阿霉素膠束表現(xiàn)出比游離阿霉素更優(yōu)越的抗原位瘤和轉(zhuǎn)移效果［8］。繼而本研究對膠束的抗轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)經(jīng)PEG-PE包載后的膠束粒徑在14 nm左右，能從正常血管中以完整形式滲出，較游離藥物在淋巴結(jié)中滯留更長時間，提示我們該膠束可能具有更好的抗淋巴轉(zhuǎn)移效果［9］。

活體光學(xué)成像技術(shù)是近幾年來發(fā)展成熟的分子影像新技術(shù)，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于實(shí)時、連續(xù)、直觀地觀測活體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。為進(jìn)一步研究PEG-PE包載藥物膠束的抗轉(zhuǎn)移效果，本研究采用活體自發(fā)光成像技術(shù)，對膠束包載的長春瑞濱抗乳腺癌的轉(zhuǎn)移療效進(jìn)行實(shí)時、連續(xù)動態(tài)的監(jiān)測，并就載藥膠束抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制進(jìn)行探討，以期深入了解藥物和載體的特性，為開發(fā)有效抗腫瘤轉(zhuǎn)移的新型藥物提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與實(shí)驗(yàn)動物

鼠源乳腺癌細(xì)胞4T1購自ATCC。RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，細(xì)胞培養(yǎng)用胎牛血清購自德國PAA公司。磷脂及其衍生物：PEG2000-DSPE購自美國Avanti Polar Lipids公司。長春瑞濱酒石酸鹽（Vinorelbine tartrate）為浙江民生制藥廠提供。實(shí)驗(yàn)動物雌性BALB/c小鼠，18～20 g，6～8周齡；購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司［許可證號：SCXK（京）2012-0001］。

1.2 方法

1.2.1 長春瑞濱膠束的制備 將適量PEG2000-PE溶于氯仿，搖勻后旋轉(zhuǎn)蒸干成脂膜，真空干燥至少1h除盡殘留的有機(jī)溶劑。加入去離子水水化脂膜，使得溶液中PEG-PE的濃度為40 mg/mL。55°C水浴水化30 min，室溫靜置2 h使其充分組裝即得到空白膠束儲液。將長春瑞濱酒石酸鹽溶于去離子水制得4 mg/mL的藥物水溶液。將該藥物水溶液與40 mg/mL的空膠束等體積混合，55°C水浴水化30 min，室溫靜置2 h使其充分包載藥物，即制得載藥膠束儲液，所得載藥膠束的藥脂比為1∶10（w/w）。將制得的藥物采用0.22 μm無菌濾膜過濾除菌，備用。

1.2.2 長春瑞濱膠束對原位瘤生長抑制作用的考察 雌性BALB/c小鼠30只，于第四乳腺墊皮下接種4T1-Luc2乳腺癌腫瘤細(xì)胞（Caliper Co.）（10萬/只）。接瘤后第4天，采用精諾真活體自發(fā)光成像系統(tǒng)（IVIS，Spectrum）檢測其原位腫瘤的光子數(shù)。依據(jù)光子數(shù)平均值相接近且從大到小均散分布的原則對小鼠進(jìn)行分組，每組10只。在接瘤第5天，采用尾靜脈注射給藥，每周一次，共2次。1）NanoVin治療組：尾靜脈注射NanoVin 10 mg/kg（含F(xiàn)ree Vin 10 mg/kg）；2）Free Vin治療組，尾靜脈注射Free Vin 10 mg/kg；3）Control對照組，尾靜脈注射PBS溶液0.2 mL/20 g。于接瘤后第14天和第21天，采用活體光學(xué)成像監(jiān)測原位腫瘤光子數(shù)并成像。在成像前，每只小鼠采用2.5%異氟烷氣體麻醉，腹腔注射150 mg/kg的D-luciferin熒光素（Caliper Life Sciences）。15 min后，采用自發(fā)光成像對小鼠進(jìn)行整體成像。其原位腫瘤部位的光子數(shù)采用成像系統(tǒng)光子數(shù)測定軟件計量。

1.2.3 長春瑞濱膠束對乳腺癌轉(zhuǎn)移作用的考察 雌性BALB/c小鼠42只，其接種乳腺腫瘤方法和接瘤后給藥方式均與1.2.1方法相同。按平均光子數(shù)相同隨機(jī)分為對照組（Control）13只，游離長春瑞賓組（Free Vin）13只，長春瑞賓膠束組（NanoVin）16只。采用活體自發(fā)光成像系統(tǒng)監(jiān)測第14天和第21天小鼠肺部腫瘤轉(zhuǎn)移部位的光子數(shù)并成像。在成像前，每只小鼠采用2.5%異氟烷氣體麻醉，腹腔注射150 mg/kg的D-luciferin熒光素。15 min后，采用自發(fā)光成像對小鼠進(jìn)行整體成像。為避免原位腫瘤強(qiáng)烈的發(fā)光信號對肺部轉(zhuǎn)移腫瘤發(fā)光信號的影響，我們采用黑色不透光袋將原位腫瘤遮住，只針對肺部轉(zhuǎn)移腫瘤進(jìn)行成像。其肺部轉(zhuǎn)移腫瘤部位的光子數(shù)采用成像系統(tǒng)光子數(shù)測定軟件計量。接瘤第31天，小鼠異氟烷麻醉，腹腔注射150 mg/kg的D-luciferin熒光素。15 min后，把小鼠斷頸處死，實(shí)施肺臟和淋巴結(jié)的解剖手術(shù)，淋巴結(jié)的分離包括腋下淋巴結(jié)（左側(cè)2～3枚，右側(cè)2枚），右側(cè)腹股溝淋巴結(jié)（1枚）。并對離體的小鼠肺臟和淋巴結(jié)進(jìn)行自發(fā)光的成像光子數(shù)監(jiān)測同時成像，其肺部和淋巴結(jié)中腫瘤光子數(shù)采用成像系統(tǒng)光子數(shù)測定軟件計量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

以SPSS 17.0軟件分析數(shù)據(jù)，采用單因素方差分析，數(shù)據(jù)以±s形式記錄。兩組間統(tǒng)計學(xué)顯著性差異檢驗(yàn)采用Student t-test。其中*表示P＜0.05，**表示P＜0.01，***表示P＜0.005。

2 結(jié)果

2.1 長春瑞濱膠束對4T1-Luc2乳腺癌原位瘤生長的抑制作用

為考察長春瑞濱膠束對4T1-Luc2乳腺癌原位瘤生長的抑制作用，在乳腺墊原位接種第4天成像并分組。第5天，分別采用PBS，游離長春瑞濱和長春瑞濱膠束給藥治療。在接瘤第14天，第21天采用活體光學(xué)成像系統(tǒng)監(jiān)測小鼠乳腺墊原位的腫瘤光子數(shù)。與對照相比，給藥組小鼠的原位腫瘤光子數(shù)均有減少。長春瑞濱膠束治療組較游離長春瑞濱藥物治療組減少更明顯（圖1A、B）。此外，第31天原位腫瘤解剖照片也表明長春瑞濱膠束治療組可顯著抑制原位腫瘤的生長（圖1C）。

2.2 長春瑞濱膠束對4T1-Luc2乳腺癌腫瘤肺部轉(zhuǎn)移的抑制作用

為考察長春瑞濱膠束對乳腺癌轉(zhuǎn)移的影響，在接瘤第14天，第21天采用活體光學(xué)成像系統(tǒng)監(jiān)測小鼠肺部腫瘤轉(zhuǎn)移部位的光子數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在接種第14天和第21天，與對照組相比，游離長春瑞濱藥物治療組和長春瑞濱膠束治療組的肺部轉(zhuǎn)移瘤光子數(shù)均有減少，尤以膠束組減少的最多，提示長春瑞濱膠束能有效抑制乳腺癌腫瘤細(xì)胞向肺部的轉(zhuǎn)移（圖2A、B）。同時，第21天肺部轉(zhuǎn)移腫瘤的自發(fā)光成像圖片顯示，對照組中僅有一只肺部未見轉(zhuǎn)移，而在游離長春瑞濱藥物治療組和長春瑞濱膠束治療組的肺部未見轉(zhuǎn)移小鼠數(shù)量增加，尤其膠束組肺部未見轉(zhuǎn)移小鼠數(shù)量最多（5/16）（圖2C）。第23天肺部解剖照片也顯示長春瑞濱膠束治療組的肺部轉(zhuǎn)移腫瘤的結(jié)節(jié)數(shù)最少（圖2D）。接瘤第31天，將解剖的肺臟和淋巴結(jié)進(jìn)行成像監(jiān)測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，游離長春瑞濱藥物治療組肺臟平均光子數(shù)為2.40×109vs.3.73×109（p/s/cm2/sr），差異為 1.33×109（P=0.33，Independed-samples t test）。長春瑞濱膠束藥物治療組肺臟平均光子數(shù)比對照：T/C是0.17（平均值為6.33×108vs.3.73×109（p/s/cm2/sr），差異為3.10×109（P=0.004，Independed-samples t test，圖3A）。解剖分離的肺部自發(fā)光成像圖片也顯示與游離長春瑞濱治療組的小鼠肺部和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移瘤相比，長春瑞濱膠束治療組的小鼠肺部的轉(zhuǎn)移顯著減少（圖3B）。

圖1 光學(xué)自發(fā)光成像監(jiān)測長春瑞濱膠束抑制4T1-luc2原位腫瘤光子不同時間成像與增長曲線圖Figure 1 Bioluminescence photon imaging and growth curve of the inhibitory effect of vinorelbine micelle on 4T1-luc2 primary tumors

2.3 長春瑞濱膠束對4T1-Luc2乳腺癌腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的抑制作用

在前期的預(yù)示驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌原位接瘤后20天后才會出現(xiàn)小鼠淋巴結(jié)部位的轉(zhuǎn)移。因此，本研究中考察了接瘤第31天接瘤小鼠淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對照組淋巴轉(zhuǎn)移小鼠個體發(fā)生率為46.2%（6/13），游離長春瑞濱藥物治療組為30.8%（4/13），而長春瑞濱膠束治療組僅有7.8%（1/13）（圖4B）。而對比發(fā)生轉(zhuǎn)移的淋巴結(jié)個數(shù)則發(fā)現(xiàn)，游離長春瑞濱治療組（9個）＞對照組（7個）＞長春瑞濱膠束治療組（1個）（圖4C）。解剖的三組淋巴結(jié)成像如圖4A所示。

圖2 光學(xué)自發(fā)光成像監(jiān)測4T1-luc2乳腺癌肺部轉(zhuǎn)移腫瘤光子量成像圖Figure 2 Bioluminescence photon imaging of the inhibitory effect of vinorelbine micelle on lung

圖3 光學(xué)自發(fā)光成像監(jiān)測4T1-Luc2腫瘤原位接種第31天解剖肺組織的轉(zhuǎn)移腫瘤光子成像圖Figure 3 Bioluminescence photon imaging of the inhibitory effect of vinorelbine micelle on lung metastasis of 4T1-luc2 breast cancer on day 31

圖4 光學(xué)自發(fā)光成像監(jiān)測4T1-luc2腫瘤原位接種第31天淋巴結(jié)解剖成像圖Figure 4 Bioluminescence imaging of lymph node metastases on day 31 after treatment

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用活體自發(fā)光成像實(shí)時、動態(tài)、直觀地考察了PEG2000-PE包載的長春瑞濱膠束抗乳腺癌原位生長和轉(zhuǎn)移的治療效果，發(fā)現(xiàn)長春瑞濱膠束在抑制原位瘤生長、阻止其遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移，尤其是淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移方面表現(xiàn)出明顯優(yōu)于游離長春瑞濱的治療效果。

目前，針對腫瘤的納米載藥系統(tǒng)一般都是基于EPR理論，即實(shí)體瘤組織由于血管內(nèi)皮細(xì)胞間隙大，血管通透性高，且缺乏淋巴回流，造成大分子藥物易透過腫瘤組織血管并在腫瘤組織中有高濃度的滯留累積［10］。故傳統(tǒng)的被動靶向納米制劑為了增加EPR效應(yīng)，粒徑一般較大，如處于臨床或臨床前研究的膠束制劑Genexol-PM、NK911、NC6004的粒徑分別在90、40、30 nm左右［5-7］。然而最近的研究表明，由于納米制劑的滲出受血管通透性的嚴(yán)格限制，在直徑小于2～3 mm的微小腫瘤，如轉(zhuǎn)移瘤中，由于血管結(jié)構(gòu)相對完好，粒徑在48 nm左右的膠束無法從該處滲出發(fā)揮作用［11］。因此，傳統(tǒng)納米載藥系統(tǒng)雖然可以有效控制原位瘤，但對轉(zhuǎn)移，尤其是淋巴系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移卻不能產(chǎn)生很好的抑制效果。而本研究采用的PEG-PE長春瑞濱膠束粒徑為14 nm，可以從正常血管中以完整形式滲出，較未包載游離藥物更多的在淋巴系統(tǒng)富集［9，12］。本研究通過活體成像實(shí)時動態(tài)地考察了長春瑞濱膠束抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的效果，直觀有力地證明了長春瑞濱膠束能有效殺死血液和淋巴系統(tǒng)這兩條路徑中轉(zhuǎn)移的腫瘤細(xì)胞，因此比游離藥物有更好的抗轉(zhuǎn)移效果。

本實(shí)驗(yàn)組已有研究表明，化療藥物經(jīng)PEG-PE膠束包載后，在提高抗腫瘤活性的同時降低藥物對機(jī)體的毒副作用。PEG-PE膠束包載阿霉素后能明顯降低阿霉素的心臟毒性［8］。本研究中NanoVin只增加了對腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用，而對正常細(xì)胞無毒性。NanoVin這種選擇性的細(xì)胞毒作用有助于它殺死腫瘤細(xì)胞并降低機(jī)體毒性［12］。NanoVin的低毒性也反映在其半數(shù)致死劑量LD50相比游離長春瑞賓增加了70%［9］。此外，NanoVin具有較小的骨髓抑制性，對注射部位的組織和血管非常低的刺激性，并大幅度的減少長春瑞賓對CYP3A4活性的抑制。NanoVin的這些特性均表明其減少了長春瑞賓藥物的毒副作用。

在本文中我們采用活體自發(fā)光成像技術(shù)考察了膠束包載藥物對抗轉(zhuǎn)移效果的影響?；铙w自發(fā)光成像因具有敏感性高，抗干擾能力強(qiáng)，以及穿透力強(qiáng)的特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于腫瘤細(xì)胞的侵潤和遷移檢測，尤其是微轉(zhuǎn)移灶的檢測上［13］。通過對同一組小鼠在不同時間點(diǎn)進(jìn)行記錄，直觀動態(tài)地監(jiān)測乳腺癌的生長并跟蹤腫瘤的轉(zhuǎn)移，使實(shí)驗(yàn)有很好的連續(xù)性，因此數(shù)據(jù)更加真實(shí)可信。我們對膠束包載的長春瑞濱抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的療效進(jìn)行了實(shí)時、連續(xù)動態(tài)的監(jiān)測，為開發(fā)有效的抗乳腺癌轉(zhuǎn)移的新型納米藥物提供了新的思路。

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（2013-09-26收稿）（2013-10-11修回）

Monitoring anti-metastasis effect of vinorelbine-encapsulated micelles on breast cancer by bioluminescence imaging

Wei LIANG;E-mail:weixx@sun5.ibp.ac.cn
Protein and Peptide Pharmaceutical Laboratory,Institute of Biophysics,ChineseAcademy of Sciences,Beijing 100101,China.

Objective:Breast cancer metastasis is a major cause of death.Lymphatic metastasis is one of the two main metastatic ways that is crucial to the metastasis process of breast cancer.To treat breast cancer metastasis,we prepared micelle-based drug carrier for lymphatic delivery.Methods:We used in vivo bioluminescence imaging for real-time dynamic monitoring of the inhibitory effect of polyethylene glycol phospholipid micelle encapsulating vinorelbine on breast cancer metastasis.Results:Compared with the free vinorelbine,vinorelbine-encapsulated micelles(NanoVin)showed a significantly enhanced anti-tumor activity both in primary and metastatic tumors.Conclusion:Intravenous administration of NanoVin markedly prevented the metastasis of tumor cells through both hematogenous and lymphatic systems.This study provides a new approach for treatment of metastatic tumors.Bioluminescence imaging is a powerful tool to dynamically monitor tumor metastasis and clinical therapeutic effect of anticancer drugs.

vinorelbine-encapsulated micelle,bioluminescence imaging,breast cancer,lymphatic metastasis

中國科學(xué)院生物物理研究所，蛋白多肽藥物實(shí)驗(yàn)室（北京市100101）

*本文課題受國家重大科技專項(xiàng)973計劃項(xiàng)目（編號：2011CB707705）資助

梁偉 weixx@sun5.ibp.ac.cn

10.3969/j.issn.1000-8179.20131858

Fayun ZHANG,Lei QIN,Wei LIANG

This work was supported by The State Key Development Plan Project(No.2011CB707705).

（本文編輯：鄭莉）