李韶今 張相民 李 榮 劉聯(lián)斌 葉永強(qiáng) 王冬梅 羅忠兵

非小細(xì)胞肺癌組織中P-ACC及COX-2的相關(guān)性研究

李韶今①張相民①李 榮②劉聯(lián)斌①葉永強(qiáng)③王冬梅②羅忠兵③

目的：探討非小細(xì)胞肺癌組織中乙酰輔酶A羧化酶磷酸化后的產(chǎn)物（P-ACC）與環(huán)氧合酶-2（COX-2）的表達(dá)及其與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及病理類型的關(guān)系，并研究兩者的相關(guān)性。方法：以62例非小細(xì)胞肺癌患者的肺癌組織作為研究組，20例因其他它原因行肺葉切除患者的正常肺組織作為對照組。應(yīng)用免疫組織化學(xué)SP法檢測肺癌組織及正常肺組織中P-ACC、COX-2的表達(dá)情況。結(jié)果：P-ACC、COX-2在非小細(xì)胞肺癌和正常肺組織中的陽性表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在非小細(xì)胞肺癌中，P-ACC的陽性表達(dá)與腫瘤大小顯著相關(guān)（P＜0.05），而與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及病理類型無關(guān)；COX-2的陽性表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及病理類型無關(guān)。P-ACC與COX-2的陽性表達(dá)之間呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-2.37，P=0.032）。結(jié)論：P-ACC在非小細(xì)胞肺癌組織中的陽性表達(dá)降低；COX-2在非小細(xì)胞肺癌組織中陽性高表達(dá)，二者呈顯著負(fù)相關(guān)，提示P-ACC陽性表達(dá)降低可能激活COX-2陽性表達(dá)，可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移。

非小細(xì)胞肺癌 P-ACC 環(huán)氧合酶-2 免疫組織化學(xué)

肺癌是世界上發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤，發(fā)病率男性和女性分別升至第一位和第二位［1-2］。非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌的80%，NSCLC早期診斷困難［3］。多年來，NSCLC以手術(shù)為主的綜合治療并沒有獲得滿意的生存率，治療后的5年生存率一直維持在40%左右，約2/3的NSCLC患者在確診時已不可切除以及術(shù)后輔助化療耐藥是NSCLC總體治療效果不佳的重要原因［4-5］。

近年不少研究顯示，NSCLC的發(fā)病機(jī)制與體內(nèi)失控的炎癥反應(yīng)相關(guān)［6］，而作為炎癥反應(yīng)重要節(jié)點(diǎn)的COX-2與NSCLC 的關(guān)系十分密切［7］，但其與P-ACC相關(guān)性的研究鮮見報道。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)SP法檢測、探討P-ACC和COX-2在NSCLC組織及正常肺組織中的表達(dá)、兩者的相關(guān)性及在NSCLC發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 病例資料 隨機(jī)選取贛州市腫瘤醫(yī)院（贛州市腫瘤防治研究所）2008年1月至2010年12月有完整臨床病理資料，病理檢查證實(shí)為NSCLC的62例患者作為研究組，20例因其他原因行肺葉切除患者作為對照組。NSCLC組，男48例，女14例；年齡21～69歲，平均55.65歲；其中鱗癌33例，腺癌16例，腺鱗癌8例，大細(xì)胞癌2例，類癌1例，淋巴上皮樣癌1例，原位癌1例。本文符合本院倫理委員會標(biāo)準(zhǔn)。

1.1.2 主要試劑及來源 P-ACC試劑購置美國Cell Signaling Technology公司，COX-2試劑購置美國Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)方法 標(biāo)本經(jīng)中性甲醛固定，石蠟包埋，常規(guī)切片，厚度約4 μm。采用免疫組織化學(xué)SP二步法。切片常規(guī)脫蠟后置蒸餾水玻璃缸，根據(jù)所應(yīng)用的一抗的特殊要求，對組織切片進(jìn)行預(yù)處理（檸檬酸pH6.0）；3%過氧化氫去離子水孵育5 min，以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；PBS沖洗、2 min×4次；滴加一抗，37℃孵育1 h，PBS沖洗，2 min×4次；滴加通用型IgG抗體-HRP多聚體，室溫或37℃孵育15 min，PBS沖洗、2 min×4次；應(yīng)用DAB溶液顯色，顯微鏡下控制，去離子水沖洗多余未結(jié)合的顯色液；水洗、蘇木素復(fù)染2 mins、1%鹽酸酒精分化2～5 s；返藍(lán)5 min、脫水、透明封片。顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.2 結(jié)果判定 在400倍視野下，每例隨機(jī)選取不重復(fù)5個視野，然后按陽性細(xì)胞占全部細(xì)胞的百分率分為：表達(dá)陰性（-），即無陽性細(xì)胞或僅有個別細(xì)胞；表達(dá)弱陽性（+），即10%＜陽性細(xì)胞數(shù)≤25%；表達(dá)中度陽性（++），即25%＜陽性細(xì)胞數(shù)≤50%；表達(dá)強(qiáng)陽性（+++），即陽性細(xì)胞數(shù)＞50%。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件完成，P-ACC和COX-2蛋白的表達(dá)情況采用等級資料的秩和檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)，P-ACC和COX-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性采用Spearman等級相關(guān)分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 P-ACC和COX-2蛋白在NSCLC組織及正常肺組織中的表達(dá)

在正常肺組織中，P-ACC蛋白染色多為陽性（16/20，80%），而在62例NSCLC組織中僅21例呈陽性染色（33.9%），統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（P=0.000 1）；COX-2蛋白染色在正常肺組織中表達(dá)較低（4/20，20%），而在62例NSCLC組織中有41例呈陽性染色（41/62，66.1%），統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著（P=0.004 0，表 1）。在NSCLC組織中，P-ACC和COX-2蛋白的陽性染色均呈淡黃色至棕褐色顆粒狀，分布于癌細(xì)胞的細(xì)胞漿部位，細(xì)胞膜和細(xì)胞核未見明顯染色（圖1，2）；P-ACC蛋白在正常肺組織中的陽性染色（圖3），COX-2蛋白在正常肺組織中的陽性染色（圖4）。

2.2 NSCLC組織中P-ACC和COX-2蛋白表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

NSCLC組織中P-ACC蛋白的陽性表達(dá)率與性別、年齡、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及病理類型均無相關(guān)性，但是P-ACC蛋白的陽性表達(dá)率與腫瘤大小密切相關(guān)，T2（3 cm＜T≤7 cm）的25.0%表達(dá)明顯低于T3（T＞7 cm）的50.0%，T3的表達(dá)明顯低于T1（T＜3 cm）的75.0%，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。COX-2的陽性表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及病理類型無關(guān)（表2）。

2.3 NSCLC組織中P-ACC和COX-2蛋白表達(dá)的關(guān)系

62例NSCLC組織中P-ACC與COX-2均表達(dá)陰性10例（16.1%）；P-ACC表達(dá)陰性，COX-2表達(dá)陽性31例（50.0%）；P-ACC表達(dá)陽性，COX-2表達(dá)陰性11例（17.7%）；P-ACC與COX-2均表達(dá)陽性10例（16.1%）。P-ACC陰性組的COX-2蛋白表達(dá)陽性率為75.6%，P-ACC陽性組的COX-2蛋白表達(dá)陽性率為 47.6%，兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表3。Spearman等級相關(guān)分析表明P-ACC表達(dá)與COX-2表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)（r=-2.37，P=0.032）。

表1 P-ACC和 COX-2蛋白表達(dá)情況Table 1 The expression of P-ACC and COX-2 proteins

?圖1 P-ACC在NSCLC中表達(dá)陽性 （H&E×100）Figure 1 Positive expression of P-ACC in NSCLC （H&E×100）

圖2 COX-2在NSCLC中表達(dá)陽性 （H&E×100）Figure 2 Positive expression of COX-2 in NSCLC （H&E×100）

圖3 P-ACC在正常肺組織中表達(dá)陽性 （H&E×100）Figure 3 Positive expression of P-ACC in normal lung tissue（H&E×100）

圖4 COX-2在正常肺組織中表達(dá)陽性 （H&E×100）Figure 4 Positive expression of COX-2 in normal lung tissue（H&E×100）

表2 NSCLC組織中P-ACC和COX-2表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系Table 2 The correlation of expression of COX-2 and P-ACC proteins with the clinicopathologic parameters of NSCLC

表3 NSCLC組織中P-ACC和 COX-2蛋白表達(dá)的相關(guān)性Table 3 The correlation between expression of P-ACC and COX-2 proteins in NSCLC

3 討論

P-ACC是腺苷酸活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）被激活后，乙酰輔酶A羧化酶（acetyl CoA carboxylase，ACC）磷酸化失活而形成的，P-ACC是AMPK的下游直接靶蛋白，可以直接反映AMPK的激活狀態(tài)［8］。AMPK激活后可顯著減輕機(jī)體炎癥介質(zhì)的表達(dá)，減少組織的炎癥損傷，比如轉(zhuǎn)染失活突變的AMPK或其siRNA可明顯增強(qiáng)脂多糖誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的TNF-α及IL-6表達(dá)，但是轉(zhuǎn)染激活型的AMPK則可以顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的TNF-α及IL-6表達(dá)［9］。動物實(shí)驗(yàn)也證實(shí)，在脂多糖暴露小鼠血清中細(xì)胞因子水平及腦組織中炎癥相關(guān)基因表達(dá)水平上，使用AMPK激活劑可以使其表達(dá)顯著降低［10］，并明顯減弱缺血再灌注小腸中白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞的黏附［11］；AMPK激活劑可明顯減輕三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的腸炎模型中結(jié)腸組織的炎癥細(xì)胞浸潤，減少破壞杯狀細(xì)胞和隱窩細(xì)胞，這些保護(hù)效應(yīng)可以使TNF-α、INF-γ和IL-17在結(jié)腸組織中的含量顯著降低［12］。另一研究也證實(shí)AMPK激活劑可以有效減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠肺組織中中性粒細(xì)胞的聚集，并可以減少、減輕肺間質(zhì)水腫，降低TNF-α和IL-6在肺泡灌洗液中的濃度［13］。以上研究說明，AMPK的活性可以調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，AMPK的失活促進(jìn)炎癥的發(fā)展。AMPK在腫瘤患者體內(nèi)活性降低，如肝細(xì)胞癌中AMPK表達(dá)下調(diào)，AMPK失活促進(jìn)肝癌的發(fā)展［14］。本研究發(fā)現(xiàn)，P-ACC在62例NSCLC組織中僅21例呈陽性染色（33.9%），較正常肺組織表達(dá)相比明顯降低，證明在NSCLC中AMPK的活性下降，AMPK的失活促進(jìn)炎癥的發(fā)展，失控的炎癥反應(yīng)可能導(dǎo)致NSCLC的發(fā)生，在NSCLC的發(fā)展初期（T＜3 cm），P-ACC的陽性表達(dá)率為75.0%，到中期（3 cm＜T＜7 cm）的陽性表達(dá)率最低為25.0%，說明隨著AMPK的活性下降，NSCLC進(jìn)一步發(fā)展；但是隨著腫瘤的進(jìn)一步發(fā)展，AMPK的活性又有所提高，在中晚期時（T≥7 cm）P-ACC的陽性表達(dá)率為50.0%，這可能與AMPK在腫瘤中的雙重作用有關(guān)，在腫瘤起始階段，AMPK失活幫助腫瘤細(xì)胞生長以及腫瘤細(xì)胞的浸潤轉(zhuǎn)移，當(dāng)腫瘤發(fā)展到一定程度時，AMPK又開始激活抑制腫瘤細(xì)胞的生長［15］。

作為炎癥反應(yīng)重要節(jié)點(diǎn)的COX-2在多個環(huán)節(jié)參與腫瘤的組成：抑制凋亡、抑制免疫功能、誘導(dǎo)腫瘤血管生成及腫瘤侵襲等［16-17］。有學(xué)者研究［18］COX-2在約1/3的不典型增生和原位癌組織中過表達(dá)，證明在癌前病變向惡性轉(zhuǎn)化中COX-2發(fā)揮了重要作用；另外該報道還證實(shí)了COX-2的著色程度在伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織中要強(qiáng)于不伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌組織。另有學(xué)者用原位雜交法研究COX-2在160例Ⅰ期NSCLC患者的癌組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示：在早期NSCLC患者中COX-2過表達(dá)預(yù)示預(yù)后較差，因此可以將COX-2過表達(dá)列為NSCLC患者獨(dú)立的不良預(yù)后因素［19］。這些研究證實(shí)在肺癌的發(fā)生、發(fā)展過程中，COX-2在凋亡受阻、免疫降低、新生血管形成、侵襲轉(zhuǎn)移等過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。本文研究也證實(shí)COX-2蛋白染色在正常肺組織中表達(dá)較低（4/20，20%），而在62例NSCLC組織中有41例呈陽性染色（41/62，66.1%），統(tǒng)計(jì)學(xué)差異顯著，并且在晚期的NSCLC中表達(dá)強(qiáng)烈。

AMPK通過磷酸化抑制炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，在炎癥的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用；COX-2也是炎癥反應(yīng)的重要節(jié)點(diǎn)；體內(nèi)失控的炎癥反應(yīng)可以導(dǎo)致上皮細(xì)胞向間葉細(xì)胞化生，進(jìn)一步促進(jìn)了肺癌的發(fā)生、發(fā)展；大量失控的炎癥反應(yīng)使機(jī)體患肺癌的風(fēng)險大大增加［20］。本研究中重點(diǎn)研究P-ACC與COX-2的關(guān)系，病例選擇上沒有特意選與這兩個參數(shù)更相關(guān)的腺癌病例，而是從NSCLC整體出發(fā)，按NSCLC中鱗癌、腺癌的發(fā)病率而大致配備，雖然近年報道腺癌發(fā)病率增加，但仍然沒有精確的數(shù)據(jù)，本研究鱗癌仍較多。因此得出P-ACC及COX-2幾乎與臨床病理參數(shù)無關(guān)，可能與病例選擇有關(guān)。但是本研究證實(shí)P-ACC陰性組的COX-2蛋白表達(dá)陽性率為75.6%，P-ACC陽性組的COX-2蛋白表達(dá)陽性率為47.6%，兩者差異有顯著性意義（P＜0.05）。Spearman等級相關(guān)分析表明P-ACC表達(dá)與COX-2表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)。說明在NSCLC中AMPK的失活可能激活COX-2陽性表達(dá)，促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移。

聯(lián)合檢測AMPK的活性與COX-2的表達(dá)有助于評估NSCLC的惡性程度和侵襲能力，從而為NSCLC的臨床防治增添新的思路，為NSCLC的治療可能提供新的靶點(diǎn)。

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（2013-08-06收稿）

（2013-10-26修回）

Correlation of P-ACC and COX-2 expression in non-small cell lung cancer tissues

Shaojin LI1,Xiangmin ZHANG1,Rong LI1,Lianbin LIU1,Yongqiang YE3,Dongmei WANG2,Zhongbing LUO3

Shaojin LI;E-mail:lsj1362@126.com
1Ganzhou Institute of Cancer Research,2Department of Pathology,Ganzhou Cancer Hospital,3Department of Thoracic,Ganzhou Cancer Hospital,Ganzhou 341000,China.

Objective:A study was conducted to determine the expression of acetyl-coa carboxylase product of phosphorylation(P-ACC)and an enzyme called cyclooxygenase 2(COX-2)in non-small cell lung cancer(NSCLC)tissue,as well as the relationship and correlations between tumor size,lymph node metastasis,clinical stage,and pathological type.Methods:Sixty-two patients with NSCLC lung cancer tissues were included in the patient group,whereas 20 patients who underwent lobectomy for other reasons and had normal lung tissues were included in the control group.Immunohistochemical streptavidin peroxidase method was used to detect the expression of P-ACC and COX-2 in lung cancer and normal lung tissues.Results:The positive expressions of P-ACC and COX-2 in NSCLC lung cancer and normal lung tissues were significantly different(P<0.05).In NSCLC tissues,the positive expression of P-ACC was significantly associated with tumor size(P<0.05),but was not significantly associated with lymph node metastasis,clinical stage,and pathological type.We found no correlation between the positive expression of COX-2 and tumor size,lymph node metastasis,clinical stage and pathological type.Further analysis revealed that the positive expression of P-ACC and COX-2 in NSCLC was significantly and negatively correlated(r=-2.37,P=0.032).Conclusion:The positive expression of COX-2 in NSCLC greatly increased compared with that of P-ACC,and a significantly negative correlation was observed between them.We propose that the positive expression of P-ACC reduction may activate the positive expression of COX-2 and promote the occurrence,development,invasion,and metastasis of NSCLC.

non-small cell lung cancer,P-ACC,COX-2,immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1000-8179.20131266

江西省贛州市腫瘤防治研究所（江西省贛州市341000）

李韶今 lsj1362@126.com

（本文編輯：周曉穎）

李韶今 教授，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事胸部腫瘤的臨床和基礎(chǔ)研究。

E-mail：lsj1362@126.com