李曉艷，楊義明，范書田，王振興，艾軍，沈育杰（中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所，吉林 長春 130112）

山葡萄（V.amurensisRupr.）屬于東亞種群，原產(chǎn)于我國東北、華北、朝鮮北部及俄羅斯遠東地區(qū)，是葡萄屬中最抗寒的一個種。野生山葡萄資源在我國長白山和小興安嶺山脈極為豐富，目前在東北三省、內(nèi)蒙古中部地區(qū)栽培普遍，是我國野生果樹馴化栽培最成功的果樹之一。山葡萄的經(jīng)濟效益和社會效益主要體現(xiàn)在以下幾個方面：一是釀造山葡萄酒的主要原料，山葡萄酒色為寶石紅，鮮艷透明，風味獨特，很受國內(nèi)外消費者歡迎；二是山葡萄果實色素含量高，是生產(chǎn)天然色素的重要原料；三是由于純種山葡萄對白粉病、黑痘病、炭疽病等有較強的抗性，尤其具有極強的抗寒性，是國內(nèi)外葡萄抗寒、抗病育種的珍貴種質(zhì)資源。

1 山葡萄種質(zhì)資源的收集、保存與鑒定

1.1 種質(zhì)資源的調(diào)查與收集

早在20世紀30年代初期，吉林省通化葡萄酒廠和長白山葡萄酒廠開始利用野生山葡萄漿果釀酒，并于1957年率先開始嘗試人工栽培山葡萄。1953～1963年間，吉林省有關(guān)部門曾多次組織多家科研單位，數(shù)十次對我國東北山葡萄集中分布區(qū)的幾十個縣、市的山區(qū)、半山區(qū)進行資源調(diào)查。目前中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所、吉林省農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所、中國農(nóng)業(yè)科學院鄭州果樹研究所、西北農(nóng)林科技大學等單位保存部分山葡萄種質(zhì)資源。中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所自1961年設(shè)立山葡萄研究課題，收集和保存性狀優(yōu)異的野生山葡萄種質(zhì)資源，其中包括在世界范圍內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)的兩性花山葡萄種質(zhì)“雙慶”和四倍體山葡萄種質(zhì)“4N1”等[1]。

1.2 種質(zhì)資源的保存

農(nóng)業(yè)部1988年出資建立了國家種質(zhì)左家山葡萄資源圃，掛靠在中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所。該圃現(xiàn)保存種質(zhì)資源400余份，主要來自黑龍江、吉林、遼寧和河北，其中從黑龍江收集的資源占65%以上。該資源圃是世界上保存山葡萄種質(zhì)份數(shù)最多的資源圃，已成為全國山葡萄種質(zhì)資源研究、教學及共享利用的平臺及山葡萄生產(chǎn)示范和優(yōu)良品種推廣的基地。除了資源圃保存外，離體保存方法能夠避免由于極端天氣原因造成種質(zhì)資源流失。其中組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)是山葡萄優(yōu)異種苗快速擴繁和種質(zhì)資源離體保存的方法之一。早在1992年，王懷蘭[2]對采用莖尖培養(yǎng)保存的種質(zhì)和常規(guī)繁殖苗進行了對比實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)組培材料繼代5a，分生能力正常，染色體無變異和常規(guī)苗相比，糖、酸及釀酒品質(zhì)等無明顯差異，宋潤剛的研究進一步發(fā)現(xiàn)組培苗和硬枝扦插苗相比較，組培樹比硬枝扦插樹晚1a開花結(jié)果，在樹形、葉形、果實形狀和色澤、酒質(zhì)、物候期、抗寒性等方面均未表現(xiàn)出明顯的變異。組培樹群體生長整齊一致，比扦插樹增產(chǎn)4.15%，具有穩(wěn)定的遺傳性狀和良好的生產(chǎn)性能[3-4]。之后，隨著組織培養(yǎng)保存技術(shù)的完善，逐步建立了穩(wěn)定的山葡萄組織培養(yǎng)方法和再生體系[5-7]。離體保存山葡萄種質(zhì)資源雖然切實可行，但是保存費用較高。張志娥等[8]研究了山葡萄種子保存方法，發(fā)現(xiàn)室溫保存的種子5a后全部喪失生活力，以-196℃，含水量3.5%的種子出苗率最高，達到74%，初步建立了低溫或超低溫保存種子的方法。

1.3 種質(zhì)資源的鑒定及遺傳多樣性分析

山葡萄種質(zhì)資源系統(tǒng)收集、保存有近30年的歷史，由于不同地區(qū)相互引種，存在著同物異名、同名異物、品種混雜等現(xiàn)象，DNA指紋圖譜為資源的鑒定提供了有力手段。王軍等[9，10]首先利用RAPD技術(shù)對7份山葡萄種質(zhì)進行了鑒定。金炳奎等[11]建立了山葡萄SRAP技術(shù)體系，利用2對引物就可鑒別6個山葡萄品種。吳子龍[12]、溫景輝[13]、樊秀彩[14]等利用SSR標記技術(shù)對山葡萄種質(zhì)資源進行了遺傳多樣性分析和山葡萄核心種質(zhì)構(gòu)建，明確了山葡萄種內(nèi)親緣關(guān)系和分類地位，SSR標記可以有效地對葡萄屬種間雜交后代進行真實性鑒定，可作為葡萄種質(zhì)創(chuàng)新的有效輔助手段。

2 山葡萄種質(zhì)資源的深度評價

在山葡萄種質(zhì)資源調(diào)查、收集和保存的基礎(chǔ)上，我國學者對山葡萄資源進行了比較系統(tǒng)的整理和分類研究，并對部分資源進行了鑒定和評價，包括結(jié)實力、果實性狀、果實品質(zhì)等生物學性狀評價[1，15]。除此外，近年來結(jié)合生物技術(shù)手段對山葡萄幾個突出特點開展的了一系列的深度評價研究，包括抗寒性、抗病性、原花青素、遺傳規(guī)律等幾個方面。

2.1 山葡萄抗寒性評價及抗寒機制分析

賀普超等[16]采用生長法、組織褐變法和電導法對原產(chǎn)我國的10個野生種葡萄抗寒性研究后指出山葡萄最為抗寒。張文娥等[17]以枝條自然失水速率和枝條冷凍處理后的電導率、萌芽率為評價指標，利用隸屬函數(shù)法綜合評價了葡萄屬12個種45份種質(zhì)資源的抗寒性，結(jié)果表明山葡萄抗寒性最強。山葡萄枝蔓可耐-40℃低溫，根系可耐-14～-16℃低溫，在我國東北地區(qū)不經(jīng)防寒可安全越冬。

隨著分子生物學技術(shù)的發(fā)展和第二代高通量測序技術(shù)應(yīng)用，可以從分子水平上對山葡萄抗寒機理進行分析，開發(fā)抗寒性狀連鎖的QTL定位和分子標記。劉鎮(zhèn)東[18]采用SSR和SRAP兩種分子標記技術(shù)分別構(gòu)建了山葡萄“雙優(yōu)”和“北冰紅”的分子遺傳圖譜，“雙優(yōu)”分子遺傳圖譜形成20個連鎖群，包含233個位點，覆蓋總圖距為1254cm，位點之間平均距離為5.0cm；“北冰紅”分子遺傳圖譜形成21個連鎖群，包含228個位點，覆蓋總圖距為1123cm，位點之間平均距離為4.5cm。成功地對葡萄抗寒性進行了初步的QTL定位，在“雙優(yōu)”遺傳圖譜中檢測到1個控制抗寒性的QTL位點，命名為SCR1，位于連鎖群SY3上。在“北冰紅”遺傳圖譜中檢測到1個控制抗寒性的QTL位點，命名為BCR1，位于連鎖群BBH14上。張劍俠等[19]利用RAPD技術(shù)找到與中國野生葡萄抗寒基因相連鎖的分子標記S241-717和S238-854。針對山葡萄的高度抗寒性，分離到山葡萄低溫誘導上調(diào)表達的抗寒轉(zhuǎn)錄因子VaCBF1[20]、CBF3[21]、CBF[22]和ICE1[23]等基因。袁紅燕

[24]將山葡萄ICE基因?qū)搿懊廊酥浮逼咸阎?，獲得了轉(zhuǎn)基因抗性株系。李海燕等[25]從山葡萄葉片中分離到一個維管組織特異表達的水楊酸強誘導型VCH3啟動子。Haiping Xin等[26]利用Solexa測序技術(shù)對非冷處理和冷處理下的山葡萄莖尖表達譜進行了測序，在轉(zhuǎn)錄水平上對山葡萄抗寒機制進行了分析，兩個文庫中差異表達序列在20倍以上的序列有66個，這部分序列可能與抗寒性相關(guān)，其中冷調(diào)節(jié)蛋白COR27，在兩個文庫間的差異倍數(shù)高達332。

2.2 山葡萄抗病性評價及抗病機制分析

賀普超[27]、王躍進[28]、王國英[29]等采用室內(nèi)接種和田間調(diào)查法研究野生葡萄的抗病能力，結(jié)果表明山葡萄對黑痘病表現(xiàn)為高抗；在自然條件下山葡萄不感染白腐病，但在接種后表現(xiàn)為抗性強；無論是在自然條件下還是室內(nèi)接種，山葡萄均不感染白粉??；對霜霉病表現(xiàn)為感病。霜霉病（Plasmopara viticola）是山葡萄最主要的病害之一，高感品種年減產(chǎn)11.8%～25.9%，嚴重時可超過50%，甚至絕產(chǎn)[30]。山葡萄兩性花品種“雙慶”、“雙豐”和雌能花品種“左山二”都因感病太重被生產(chǎn)淘汰[31]。李曉紅[32]使用田間自然發(fā)病調(diào)查和室內(nèi)離體葉圓片接種鑒定的方法，評價研究了150份山葡萄種質(zhì)資源對霜霉病的感病性，結(jié)果表明在山葡萄種內(nèi)雖然沒有對霜霉病免疫的山葡萄品種，但不同種質(zhì)之間感病性存在著明顯的差異。

霜霉病是造成山葡萄減產(chǎn)的主要原因，但是目前尚未發(fā)現(xiàn)免疫品種或類型，也沒有有效的藥物能夠根除此病[33]。了解誘發(fā)霜霉病的機制是解決這一難題的前提，Jiao Wu等[34]利用Solexa技術(shù)對山葡萄“左山一”感染霜霉病和未感染霜霉病葉片進行表達譜測序，在分子水平上對霜霉病誘發(fā)機制進行了分析，兩個文庫中差異表達序列在5倍以上的序列占0.9%，其中在感病文庫中差異倍數(shù)超過20的序列有69條，這部分序列可能與霜霉病相關(guān)。針對山葡萄易感霜霉病，江源等[35]從山葡萄品種“雙優(yōu)”突變株中分離到降解病原真菌細胞壁功能的山葡萄PR蛋白-幾丁質(zhì)酶基因VCH3，并構(gòu)建該基因的植物表達載體，為葡萄抗霜霉病的分子育種奠定了基礎(chǔ)。

2.3 山葡萄功能性成分評價及合成途徑分析

山葡萄籽中富含原花青素，其中黃酮類物質(zhì)含量達12%，是歐亞種葡萄的4～8倍，是目前已知原花青素最豐富的資源[36]。王新偉等[36]采用香草醛-HPLC結(jié)合法對39份山葡萄種質(zhì)資源的種子、果皮中原花青素含量進行測定，山葡萄種質(zhì)資源原花青素含量存在較大變異，成熟果實種子與果皮原花青素含量變化幅度較大，變化范圍分別為0.42～8.00mg/g FW和1.2～14.7mg/g FW。趙權(quán)等[37]以7個品種山葡萄為試驗材料，應(yīng)用HPLC－MS/MS技術(shù)，分析不同品種山葡萄果皮和酒中非花色苷酚成分的差異，包括苯甲酸類、肉桂酸類、黃烷－3－醇類、黃酮醇類、白藜蘆醇類等，果皮中共檢測出18種非花色苷，酒中共檢測出30種非花色苷酚。

針對山葡萄花青素合成途徑，李鳳等[38]和李波等[39]成功構(gòu)建了山葡萄“雙紅”成熟果皮和“雙豐”轉(zhuǎn)色期果皮cDNA文庫，發(fā)現(xiàn)了花色苷合成途徑和抗病防御的相關(guān)基因，如谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、鋅指蛋白、查爾酮合成酶和花青素3-O-葡萄糖苷轉(zhuǎn)移酶等，為克隆山葡萄花色苷生物合成、果實成熟及防御抗病相關(guān)的基因提供了基礎(chǔ)。劉海峰[40]從山葡萄成熟期果皮中克隆到了花青素合成途徑的8個主要酶基因的cDNA全長序列，并對這些基因在山葡萄幼葉、成熟葉、莖、果肉和果皮中的表達進行了研究。Chen Wang等[41]利用Solexa技術(shù)對山葡萄小RNA文庫進行了測序，共確定了27個miRNA家族的126個保守miRNAs，發(fā)現(xiàn)72個新的潛在的山葡萄特定的miRNA，對346個新的miRNA的靶基因進行了預測，包括一些抗逆性基因、花青素的合成和糖代謝調(diào)節(jié)基因等。

2.4 山葡萄遺傳規(guī)律研究

為研究山葡萄抗寒力在種間雜交后代中的遺傳規(guī)律，王軍等[42]對4種雜交模式82個雜交組合的近8000株雜種苗抗寒力進行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)（AA山×BB歐）F1×AA（山）的抗寒力最強，（AA山×BB歐）F1×BB（歐）后代抗寒力最弱。林興桂[43]對山葡萄種內(nèi)雜交后代抗寒力、花型和果實性狀的遺傳進行了研究，發(fā)現(xiàn)雜種一代抗寒力未出現(xiàn)分離，雌能花與雄花、雌能花與兩性花的比例均接近1∶1，果穗重量超親的植株占30.12%～90.03%。

中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所于1973～2005年間，用低酸高糖抗寒的種質(zhì)資源山葡萄（品種、品系）進行種內(nèi)雜交，再與不抗寒的歐亞種葡萄中著名的釀酒品種進行種間雜交、回交和重復雜交，以使這些種質(zhì)優(yōu)良性狀組合在一起，試圖摸索出山葡萄種內(nèi)和種間雜交后代果實總酸和糖含量遺傳規(guī)律。結(jié)果發(fā)現(xiàn)山葡萄種間雜交后代F1～F4對霜霉病抗性分離，表現(xiàn)為連續(xù)分布，傾向于抗病親本。霜霉病抗性為多基因控制的數(shù)量性狀遺傳、“抗病基因”有累加效應(yīng)、呈顯性遺傳給后代。已選育出抗霜霉病、抗寒、可釀造干紅山葡萄酒的新品種左優(yōu)紅、品系94-7-75、94-8-168、95-2-482 和 2002-1-135[31，44]。山葡萄種內(nèi)和種間雜交后代（F1，F(xiàn)2）果實成熟期分離，表現(xiàn)為連續(xù)分布，傾向于早熟親本。雜交組合中早熟親本越多，分離出的早熟單株越多，為多基因控制的數(shù)量性狀遺傳?！霸缡旎颉庇欣奂有?yīng)、呈顯性遺傳給后代[45]。果實總酸含量主要受雙親遺傳因素的影響，趨向高酸親本；后代果皮色素（色價）群體表現(xiàn)為趨中變異，但也受雜交親本相互影響，單寧平均含量均都比高單寧親本高，表現(xiàn)為超親遺傳[46-47]。

山葡萄花型的遺傳符合Levadou的假說，受M、H、F這3個等位基因控制[48]。野生狀態(tài)下，雄花植株基因型為異質(zhì)MF，目前發(fā)現(xiàn)唯一的兩性花種質(zhì)資源“雙慶”基因型為異質(zhì)HF，雌能花植株基因型為FF。人工雜交以后可以產(chǎn)生基因型為HH的兩性花植株和基因型為MH的雄花植株。目前山葡萄植株性別分雌株、雄株和兩性花3種類型。中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所從2002年起開展對山葡萄雄株進行性別轉(zhuǎn)換研究，已經(jīng)建立了穩(wěn)定的山葡萄雄株性反轉(zhuǎn)調(diào)控體系，山葡萄雄株花序經(jīng)過100mg/L的CPPU處理后轉(zhuǎn)變成了兩性花，并從雌雄配子體發(fā)育[49]、花粉萌發(fā)、果實性狀、內(nèi)源激素、蛋白質(zhì)組學等方面揭示了山葡萄雄株花朵性別轉(zhuǎn)換與各因素間的內(nèi)在聯(lián)系[50]。Xu等[51]發(fā)現(xiàn)腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶是山葡萄雄株性別轉(zhuǎn)換的關(guān)鍵蛋白質(zhì)，直接或間接參與山葡萄花器官的生長發(fā)育。另外，利用分子生物學手段找到了和山葡萄性別相關(guān)的分子標記。王軍等[52，53]利用RAPD技術(shù)找到雄性山葡萄相關(guān)標記OPA18-700。唐美玲等[54]利用AFLP技術(shù)找到與山葡萄雄花與兩性花相關(guān)的分子標記并成功轉(zhuǎn)化成SCAR標記，盲測準確率達到97.6%，可對山葡萄雜交后代在苗期進行性別鑒定，提高育種效率。

3 山葡萄種質(zhì)資源的利用

山葡萄是我國東北地區(qū)釀制著名山葡萄酒的原料，為了篩選適宜加工的山葡萄品種，多家科研單位通過野外實生選種、種內(nèi)雜交、種間雜交等育種途徑，開展了山葡萄品種選育（表1）和配套栽培技術(shù)研究。

中國農(nóng)業(yè)科學院特產(chǎn)研究所是國內(nèi)開展山葡萄研究比較早的單位之一，1963年從野生資源中發(fā)現(xiàn)兩性花山葡萄，1975年命名“雙慶”，成為我國第一個兩性花山葡萄品種[1]。1984～1988年從野生資源中選育出“左山一”和“左山二”2個雌能花品種，并進行大面積生產(chǎn)栽培，使山葡萄每公頃平均產(chǎn)量達到 12～14t[55，56]。1974 年開始了以“雙慶”為父本，優(yōu)良雌能花品系為母本進行種內(nèi)雜交選育兩性花新品種的研究，從雜交一代中選育出“雙豐”、“雙紅”和“雙優(yōu)”3個兩性花品種，使山葡萄每公頃產(chǎn)量達到 15～17t[57，58]。1973～2014 年，開展山葡萄（品種、品系）種內(nèi)雜交，再與不抗寒的歐亞種葡萄進行種間雜交、回交和重復雜交，先后選育出優(yōu)良的種間雜交品種“左紅一”、“左優(yōu)紅”、“北冰紅”、“雪蘭紅”，使山葡萄每公頃平均產(chǎn)量達到20～22t[59-62]。這些品種不但很好的保持了山葡萄的典型特征，更具有產(chǎn)量高、酒質(zhì)好等特點。

表1 培育和審定的山葡萄品種簡介

另外，吉林省農(nóng)科院果樹所采用“玫瑰香”和山葡萄進行雜交，選育出“公釀一號”和“公釀二號”2個優(yōu)良品種[63]。中國科學院植物研究所同樣采用“玫瑰香”和山葡萄的雜交組合形式，選育出“北醇”、“北玫”和“北紅”3個優(yōu)質(zhì)抗寒新品種[64-66]。黑龍江省牡丹江市果樹所從野生資源中選出優(yōu)良單株，命名“牡山1號”[67]。這些品種及栽培技術(shù)先后在我國東北三省及內(nèi)蒙古推廣，目前我國山葡萄的栽培面積已達到1.23萬hm2左右[63]。

4 山葡萄種質(zhì)資源未來的研究方向

4.1 擴大山葡萄種質(zhì)資源的收集范圍，建立高效的保存方法

山葡萄種質(zhì)資源分布較廣，遺傳多樣性十分豐富，除了注重對具有特異性狀，如抗病、高糖、低酸、兩性花山葡萄種質(zhì)資源的收集，還要加強國外優(yōu)異資源的收集，尤其是與俄羅斯等研究較早和深入的國家建立交流與合作關(guān)系，引進特色山葡萄品種和品系。開展超低溫保存方法的研究，確定最佳的外植體的保存類型和保存方法。

4.2 建立完善的評價體系，開展特異性狀的深度評價

建立山葡萄抗寒性、抗病性、耐鹽性評價體系，并對其抗性機制進行分析，篩選抗性種質(zhì)和抗性基因。開展山葡萄特異性狀和對人體有益的功能性成分的評價，如白藜蘆醇、原花青素等，篩選優(yōu)異種質(zhì)資源，將有利于山葡萄資源的高效利用。

4.3 調(diào)整育種目標，突出研究重點

山葡萄育種目標應(yīng)從單純的高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)轉(zhuǎn)為以優(yōu)質(zhì)為基礎(chǔ)的綜合抗逆性強的品種上來，把抗霜霉病作為今后育種的重點。充分利用現(xiàn)有資源，選育優(yōu)異的兩性花品種、培育白果山葡萄、小葉山葡萄是將來的育種目標。

4.4 選擇優(yōu)異的雜交組合，對特異性狀進行分子標記和基因定位

分子標記輔助育種手段在山葡萄上的應(yīng)用更多地體現(xiàn)在種質(zhì)資源的鑒定和遺傳多樣性分析，而真正對主要經(jīng)濟性狀的分子標記報道較少。隨著第二代測序技術(shù)的推廣和應(yīng)用，更多的SSR和SNP被發(fā)掘，可以構(gòu)建高密度的山葡萄遺傳圖譜，有目的選擇雜交組合，構(gòu)建優(yōu)異的雜交組合群體，對特異性狀如抗寒、抗病基因進行QTL定位和分析。

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