葉 俊 陳 敏 黃雪芳 劉承偉

(桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院急診科，廣西 桂林 541004)

帕金森病(PD)是中老年人常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其發(fā)病機制至今尚未闡明，在早期如何通過一系列的干預手段預防或延緩PD的發(fā)生發(fā)展則具有重大意義。目前傾向于認為氧化應激水平的提高是PD重要的病理生理機制之一〔1～3〕。在氧化應激時，與幼年動物相比，老年動物對蛋白質(zhì)的損傷更敏感，并且動物暴氧化應激狀態(tài)時所導致的酶學改變與衰老時變化相似。綠茶多酚(GTPs)是一種抗氧化劑,是綠茶中所提取的多酚類化合物，含豐富的兒茶素，其中以表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)含量最多，占兒茶素含量的50%～60%，被認為是GTPs的主要活性物質(zhì)，具有抗氧化、清除自由基的積極作用〔4，5〕，在許多神經(jīng)變性疾病中顯示出神經(jīng)保護作用。本研究以神經(jīng)毒素1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氫吡啶(MPTP)注射C57BL/6J老年小鼠建立PD模型，研究預防性GTPs干預是否存在對PD老年模型多巴胺能神經(jīng)元存在更好的保護和修復作用并進一步探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 健康雄性C57BL/6J小鼠，SPF級，18月齡60只，體重20～25 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，許可證編號：SCXK(京)2009-0004；飼養(yǎng)條件：桂林醫(yī)學院SPF級實驗動物飼養(yǎng)室，許可證號：SYXK桂2007-0001。飼以實驗動物中心提供的飼料(成分為大米粉、玉米粉、魚粉等)。自由攝食、飲水，適應環(huán)境1 w后進行實驗。實驗室溫度25℃～28℃，通風、自然采光。

1.2主要試劑 GTPs，由浙江東方茶業(yè)科技有限公司提供， 生產(chǎn)批號為20070518， GTPs純度100%，其中EGCG 含量為70.75%。MPTP購自Sigma公司。兔抗酪氨酸羥化酶抗體(TH)由Bioworld 公司提供，超氧化物歧化酶(SOD)試劑盒和丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成公司。其他試劑均為國產(chǎn)或進口分析純。

1.3動物分組及處理 隨機分成預防組、MPTP組、治療組和空白對照組，各組均為15只。MPTP處理方式為腹腔注射MPTP(30 mg/kg)，1次/d，連續(xù)7 d；GTPs干預方式為在小鼠飲水中摻入GTPs，濃度為0.1%(W/V)。

模型組：每日上午MPTP處理。預防組：注射MPTP前3個月開始GTPs干預MPTP處理。治療組：MPTP處理后開始GTPs干預3個月?？瞻讓φ战M：腹腔注射同體積的生理鹽水，連續(xù)7 d。

1.4黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目測定 各組動物各取7只進行免疫組織化學方法測定黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目。麻醉動物后以4%多聚甲醛經(jīng)心灌注斷頭取腦后固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，連續(xù)冠狀切片(片厚4 μm)，隔三取一，后行TH染色：二甲苯梯度脫蠟，無水乙醇，95%乙醇，蒸餾水進行水化處理，0.01 mol/L PBS洗3次；切片甩干，用免疫組化專用油筆在腦切片周圍畫圈；3%過氧化氫室溫孵育30 min；0.01 mol/L PBS洗3次；加封閉液室溫20 min；加TH(1∶200)4℃過夜； 0.01 mol/L PBS洗3次；加二抗(1∶200)室溫，2 h孵育；0.01 mol/L PBS洗3次；加鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶(1∶100)，室溫1 h。DAB液顯色3～10 min；PBS終止反應；蘇木素復染5 min；梯度酒精脫水，中性樹脂封片。

1.5SOD和MDA水平測定 各組動物各取8只進行SOD和MDA水平測定。小鼠迅速斷頭取腦,冰上分離中腦腹側(cè)組織，吸干稱重后置于勻漿器內(nèi)充分勻漿，低溫 14 000 r/min離心30 min，參照試劑盒說明書分別測定氧化應激標志物SOD和脂質(zhì)過氧化物MDA水平。

2 結(jié) 果

2.1黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元計數(shù)結(jié)果 TH陽性神經(jīng)元胞體聚集于黑質(zhì)致密區(qū)(SNc)，突起密集分布于黑質(zhì)網(wǎng)質(zhì)區(qū)(SNr)。與空白對照組TH陽性細胞數(shù)量(235±22.5)比較，預防組(201±20.5)、治療組(185±21.9)、MPTP組(150±23.2)均明顯降低(P<0.01)，但預防組降低幅度最小。見圖1。

圖1 小鼠腦組織黑質(zhì)TH疫組織化學染色(×100)

2.2SOD和MDA水平測定 MPTP組、預防組和治療組SOD水平均較空白對照組降低(P<0.01)，而MDA水平則相反(P<0.01)，變化幅度預防組<治療組

表1 各組SOD和MDA測定結(jié)果

3 討 論

PD是與衰老密切相關的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，平均發(fā)病年齡為60周歲，故而本實驗選擇老年動物建立模型，力求最大限度接近PD真實的發(fā)病背景。衰老與氧化應激反應之間的密切關系已被許多實驗所研究并證實。衰老是由于自由基進攻細胞，過度氧化所致。隨著年齡增長自由基清除劑活性下降，大量有害自由基會破壞組織細胞，組織器官的機能逐步發(fā)生紊亂及障礙，過多的活性氧自由基就會有破壞行為，導致人體正常細胞和組織的損壞，心臟病、老年癡呆癥、PD和腫瘤等疾病就會接踵而來。 以MPTP成功誘導C57BL/6J老年小鼠建立經(jīng)典的亞急性PD模型后用GTPs進行干預,發(fā)現(xiàn)GTPs能夠有效減少MPTP造成的黑質(zhì)多巴胺神經(jīng)元的丟失、降低SOD及提高MDA水平和活性，增加抗氧化能力，尤其是在損傷前使用GTPs干預的預防組各項指標均優(yōu)于GTPs后處理的治療組。

PD特征性病理變化為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的大量變性缺失，當達到60%～80%水平時就會出現(xiàn)靜止性震顫、肌強直、運動遲緩等典型癥狀。本實驗應用GTPs干預后證實GTPs能夠減少多巴胺能神經(jīng)元的缺失起到保護作用，而在損傷前進行預防性用藥則能達到更佳效果。PD發(fā)病機制至今不甚明了，但是隨年齡增長同時升高的氧化應激水平已為大多數(shù)學者所關注和認同的研究熱點〔6〕?？寡趸穷A防衰老的重要步驟，因為自由基或氧化劑會將稀薄的組織分解，影響代謝功能，并會引起不同的健康問題。

SOD和MDA等抗氧化指標的測定是研究氧化應激水平的常用手段。EGCG是GTPs的重要活性成分，主要以原型存在于血液和靶器官中，且能夠通過血腦屏障(BBB)進入神經(jīng)系統(tǒng)〔7〕，成為其發(fā)揮神經(jīng)保護作用的前提。預防性使用GTPs，將整體內(nèi)環(huán)境包括神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的抗氧化能力和清除自由基的功能〔8〕在病變之前先提升到更高水平或減少由衰老所致過多的氧自由基，降低體內(nèi)自由基水平，同時促進內(nèi)源性抗氧化酶如SOD的生成，從而提高發(fā)生病理改變的閾值，在同等的致病條件下能降低被損傷程度和范圍，最大限度的保護包括黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元在內(nèi)的神經(jīng)系統(tǒng)，其效果遠遠大于病變之后的治療性用藥的神經(jīng)修復作用。外源性補充GPTs，通過抗氧化、抗炎等廣泛的生物活性途徑對多巴胺能神經(jīng)元進行保護和修復，作為防治PD及其他神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病可能的安全的潛在性途徑，具有良好的研究價值和應用前景。

4 參考文獻

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