王樹東 丁麗娟 王 倩 李 特 劉 全

(吉林大學第一醫(yī)院,吉林 長春 130012)

急性心肌梗死(AMI)后心肌細胞凋亡，左心室心肌細胞凋亡后心室重構使AMI患者左心室功能嚴重受損，死亡率明顯增加〔1〕。Bcl-2/Bax是參與凋亡的重要基因家族之一，Bcl-2/Bax比例失衡即Bax相對過表達在AMI的病變中起重要作用〔2〕。研究證實銀丹心腦通軟膠囊能夠改善腦缺血〔3〕，緩解心肌缺血，增加冠脈血流量，擴張狹窄的冠脈及改善冠脈側支循環(huán)，治療AMI具有很好的作用〔4，5〕。針對AMI的動物研究顯示，銀丹心腦通軟膠囊可抑制梗死后心肌細胞凋亡〔6〕，但具體機制尚無報道。本實驗通過觀察銀丹心腦通軟膠囊對AMI后大鼠心肌Bcl-2、Bax表達的影響探討其防治AMI后心肌細胞凋亡的機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 銀丹心腦通軟膠囊(貴州百靈企業(yè)集團制藥有限公司)，卡托普利(上海施貴寶公司)，TUNEL試劑盒(德國寶靈曼公司)，TRIZOL(invitrogen)，M-MLV 逆轉錄酶、DNA Marker(Takara)，dNTP、(oligo)dT(上海生工生物工程技術服務有限公司)，其他試劑為國產分析純。

1.2梗死動物模型建立及分組 90只Wistar大鼠雌雄各半，結扎冠脈前降支建立AMI模型。術后24 h存活大鼠隨機分為，模型組、銀丹心腦通大劑量組(1.6 g·kg-1·d-1)、銀丹心腦通小劑量組(0.8 g·kg-1·d-1)、陽性藥對照卡托普利組(5 mg·kg-1·d-1)各12只，假手術組(只穿線不結扎)10只。各給藥組均灌胃1次/d，共4 w，模型組與假手術組給予同等劑量生理鹽水作為對照。

1.3AMI范圍測定 動物心臟稱重，將左心室心肌橫切4～5 片，然后浸入N-BT 磷酸緩沖液中，置37℃恒溫水浴，待染色完全后取出，正常組織染色，缺血組織不染色。照相后圖像軟件分析，用缺血心肌占左心室心肌面積的百分比計算MIS。

1.4RT-PCR 檢測Bcl-2/Bax mRNA表達 取凍存的左心室心肌組織，采用TRIZOL一步法常規(guī)提取總RNA。Bcl-2、Bax及 GAPDH PCR引物由 Takara 合成，PCR產物大小分別為427、469、700 bp，GI22010型全自動凝膠成像系統(tǒng)(Tanon,中國)成像并比較Bcl-2、Bax mRNA與GAPDH mRNA 的相對表達量。

1.5脫氧核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法(TUNEL)染色 取病變部位的心肌常規(guī)脫水固定，石蠟包埋、切片，寶靈曼公司試劑盒(POD) 提供的TUNEL原位檢測凋亡細胞的DNA碎片。以單位面積內凋亡細胞數(shù)為計算凋亡指數(shù)(AI)。

2 結 果

2.1左室梗死范圍 模型組大鼠左室梗死范圍明顯高于假手術組(P<0.05)；銀丹心腦通軟膠囊的大、小劑量組及卡托普利組較模型組明顯減小(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠左室截面直徑及梗死范圍比較

2.2心肌細胞AI 與假手術組(1.25±0.87)相比，梗死模型組左心室非梗死區(qū)的心肌細胞AI(23.33±3.87)顯著增加(P<0.05)。銀丹心腦通軟膠囊大、小劑量組(9.33±1.37；12.58±2.07)和卡托普利組AI(11.17±2.66)明顯低于模型組(P<0.05)。

2.3RT-PCR檢測Bcl-2/Bax mRNA表達情況 與模型組比較，各給藥組Bcl-2 mRNA表達增加(P<0.05)，以銀丹大劑量組最明顯，小劑量與卡托普利組間無明顯區(qū)別。

大鼠AMI 4 w后，假手術組心肌Bax mRNA僅有少量表達，模型組較假手術組表達明顯增多(P<0.01)。與模型組比較，各給藥組Bax mRNA表達減少(P<0.05)，以銀丹大劑量組最明顯，小劑量與卡托普利組無明顯區(qū)別。見圖1。

1：假手術組；2：模型組；3：銀丹心腦通大劑量組；4：銀丹心腦通小劑量組；5：卡托普利組

3 討 論

銀丹心腦通軟膠囊主要成分為銀杏葉、丹參、燈盞細辛、三七、大蒜、絞股藍、山楂、冰片，其單味藥的基礎和臨床研究已取得了重大進展，大部分單味藥已經精制成靜脈注射劑廣泛使用，療效也得到了國內外的認可。銀丹心腦通軟膠囊兼顧了對冠心病重要危險因子的調理，急緩兼顧，長期應用對控制患者病程進展、預防冠心病事件發(fā)生具有重要意義。

Bcl-2和Bax 是一對凋亡調節(jié)蛋白，參與細胞凋亡線粒體途徑的調節(jié)。Bcl-2主要位于線粒體膜、核膜和內質網膜，具有抗細胞凋亡作用。Bax定位于細胞質中，可在凋亡誘導因素作用下發(fā)生構型變化，從細胞質移位到線粒體膜，與Bcl-2形成異源二聚體抑制Bcl-2的活性，增加線粒體膜的通透性，使線粒體膜上通透性轉換孔開放，導致細胞色素C、(Cyt C)凋亡誘導因子等釋放到細胞質中。釋放到細胞質中的Cyt C 與胞質中的凋亡蛋白酶激活因子-1和Caspase-9酶原結合形成凋亡酶體，生成有活性的Caspase-9，觸發(fā)凋亡蛋白酶的級聯(lián)反應引起細胞凋亡的發(fā)生。Bax自身也可形成同源二聚體，同源二聚體Bax/Bax的比例大于異源二聚體Bcl-2/Bax時，會促進心肌細胞的凋亡，反之會抑制細胞凋亡。Li等〔7〕認為由于心臟收縮時壞死心肌向外膨出，反常被動張力的產生使壞死心肌承受更大的壁應力，導致細胞內鈣水平明顯增加，完整的線粒體膜遭到破壞，線粒體通透性孔開放，導致凋亡〔8〕。本實驗提示銀丹心腦通軟膠囊可能通過抑制Bax的表達，減少心肌細胞凋亡。

4 參考文獻

1Rosenkranz S.TGF-β1 and angiotensin networking in cardiac remodeling〔J〕.Cardiol Res，2004；63(3):423-32.

2Misao J，Hayakawa Y，Ohno M,etal.Expression of Bcl-2 protein，an inhibitor of apoptosis，and Bax，an accelerator of apoptosis，in ventricular myocytes of human hearts with myocardial infarction〔J〕.Circulation，1996；94(7):1506-12.

3衛(wèi) 國,阮波群.銀丹心腦通軟膠囊治療急性腦梗死患者80例〔J〕. 中西醫(yī)結合心腦血管病雜志,2013；11(3)：326-7.

4黃 炯.銀丹心腦通軟膠囊治療冠心病心絞痛的臨床研究〔J〕.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志,2007；6(5)：385-7.

5駱 瓊,馬 麗,葉瑞林,等.銀丹心腦通軟膠囊治療慢性穩(wěn)定型心絞痛臨床觀察〔J〕.上海中醫(yī)藥雜志,2013；47(1)：44-6.

6蓋玉生,左魯寧,喬衛(wèi)衛(wèi),等.銀丹心腦通軟膠囊抑制大鼠急性心肌梗死后心肌細胞凋亡〔J〕.上海中醫(yī)藥雜志,2013；47(1)：55-7.

7Li Y，Takemura G，Kosai K,etal.Critical roles for the Fas/Fas ligand system in postinfarction ventricular remodeling and heart failure〔J〕.Cir Res，2004;95(6)：627-36.

8Oskarsson HJ,Coppey L, Weiss RM,etal.Antioxidants attenuate myocyte apoptosis in the remote non-infarcted myocardium following large myocardial infarction〔J〕.Cardiovas Res，2002;45(3):679-87.