謝朝陽 吳斌華 陳小芳 陳秋生 祝 娟 祝其鋒

(廣東醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，廣東 湛江 524023)

原花青素(PAC) 以其高效、低毒、高生物利用度而被不斷研究開發(fā)，研究表明PAC有抗動脈粥樣硬化、抗氧化損傷等作用。本課題組前期研究結(jié)果提示PAC可劑量依賴性對抗Aβ25～35對PC12細(xì)胞的毒性作用，其保護(hù)神經(jīng)元受損機(jī)制可能與逆轉(zhuǎn)紊亂的細(xì)胞周期有關(guān)〔1〕。近來研究結(jié)果表明，PAC可抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡〔2〕，阻滯細(xì)胞周期〔3〕等，起到抗腫瘤的作用。但國內(nèi)外關(guān)于PAC對白血病細(xì)胞的作用研究極少，本文以人急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株HL-60為模型，探討PAC對HL-60細(xì)胞增殖、分化及凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞、試劑、儀器 HL-60 細(xì)胞購于中科院上海細(xì)胞庫。胎牛血清為杭州四季青生物工程材料有限公司產(chǎn)品；RPMI1640購自GIBCO公司；CD14、CD11b 為BD Pharmingen產(chǎn)品；CCK-8試劑盒購于碧云天；各種規(guī)格培養(yǎng)皿均為美國Corning Costar公司產(chǎn)品；其余試劑為國產(chǎn)分析純。EPICS XL流式細(xì)胞儀為美國COULTER公司；OLYMPUS BX41光學(xué)顯微鏡為日本OLYMPUS，SSC-DC83P攝像頭為日本SONY公司。M450型ELISA Reader 酶標(biāo)儀為美國Bio-Rad公司。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物 PAC購于南京清澤醫(yī)藥公司，為葡萄籽提取物，質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于95%，用DMSO溶解配成貯存液，DMSO終濃度<0.1%(V/V)。

1.3方法

1.3.1細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)在含12% 胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中(內(nèi)含0.1% 青霉素)，置于37℃、5%CO2孵育箱內(nèi)備用。

1.3.2CCK-8法檢測 HL-60細(xì)胞增殖抑制 用WST-8(CCK-8)細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測試劑盒檢測。取對數(shù)生長期細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)為1×105cells/ml，于96孔培養(yǎng)板中每孔加100 μl，細(xì)胞濃度為1×104cells/ml，加入不同終濃度的PAC，對照組除未加PAC外其余條件完全一致，置37℃、5%CO2、飽和濕度孵箱中培養(yǎng)24 h、48 h和72 h。培養(yǎng)至實(shí)驗(yàn)時間結(jié)束前3 h，各孔加入10 μl的CCK-8溶液，繼續(xù)孵育3 h，測定450 nm處的OD值，重復(fù)三次，以藥物濃度為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)繪制增殖抑制曲線。

1.3.3細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 調(diào)整HL-60細(xì)胞數(shù)為2×105/ml，每孔2 ml種入6孔板中，加終濃度分別為20 mg/L、40 mg/L的PAC誘導(dǎo)24 h、48 h，離心收集細(xì)胞，用PBS洗2次，去上清，制細(xì)胞涂片，用Wright染色，光鏡觀察形態(tài)變化。

1.3.4流式細(xì)胞檢測細(xì)胞周期變化 取對數(shù)生長期的HL-60細(xì)胞以3×108個/L接種于6孔板，每孔加2 ml，加入終濃度為20 mg/L、40 mg/L的PAC，培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞至1.5 ml EP管中，PBS洗2次，800 r/min 離心10 min，70% 乙醇-20℃固定過夜，用PBS洗1次，1 200 r/min離心10 min，每管加PI至終濃度為50 mg/L，37℃避光孵育30 min，過濾后上機(jī)檢測。每個樣品計數(shù)10 000個細(xì)胞，每組重復(fù)3次取平均值。

1.3.5細(xì)胞表面分化檢測 調(diào)整HL-60細(xì)胞數(shù)為2×105/ml，每孔2 ml種入6孔板中，加終濃度分別為20 mg/L的PAC誘導(dǎo)24、48 h，采用FCM檢測髓系主要分化抗原CD14 、CD11b表達(dá)變化。離心收集細(xì)胞，分別加入鼠抗人FITC-CD14單抗和PE-CD11b單抗5 μl，加PBS至100 μl ，4℃孵育30 min，PBS洗，1次，重懸于PBS，經(jīng)400目尼龍網(wǎng)過濾，用流式細(xì)胞儀檢測CD14和CD11b抗原表達(dá)。

2 結(jié) 果

2.1PAC對HL-60細(xì)胞生長增殖的影響 不同濃度PAC處理HL-60細(xì)胞24、48 h，用CCK-8法檢測細(xì)胞存活率，結(jié)果顯示作用24 h，隨PAC濃度從5～40 mg/L逐漸增高，細(xì)胞存活率逐漸降低(P<0.05)，表明PAC對細(xì)胞的抑制作用隨濃度的增大而增強(qiáng)(圖1)。當(dāng)PAC濃度為20 mg/L時，HL-60細(xì)胞的增殖抑制率為(72.3±1.8)%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度PAC作用HL-60細(xì)胞48 h，增殖抑制率比24 h的稍高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義，且50 mg/L PAC作用HL-60細(xì)胞48 h，細(xì)胞出現(xiàn)死亡現(xiàn)象。

圖1 PAC對HL-60細(xì)胞生長增殖的影響

2.2細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 細(xì)胞涂片經(jīng)Wright染色，油鏡下可見，未經(jīng)藥物作用的HL-60細(xì)胞胞體大、核大、多為圓形、核仁清晰、胞質(zhì)深染、核質(zhì)比例大。經(jīng)20 mg/L PAC作用24 h，少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)核凹陷變形；作用48 h部分細(xì)胞體積變小，核形變得不規(guī)則，呈現(xiàn)腎形、分葉狀等，核仁不清或消失，胞質(zhì)變多，部分可見染粉紅色，提示部分細(xì)胞分化為較成熟階段細(xì)胞。而40 mg/L的PAC作用HL-60細(xì)胞48 h，細(xì)胞則出現(xiàn)凋亡改變，細(xì)胞核固縮、碎裂(箭頭所示)，見圖2。

圖2 HL-60細(xì)胞形態(tài)觀察

2.3PAC對HL-60細(xì)胞細(xì)胞周期分布的影響 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示，經(jīng)PAC(5～20 mg/L) 處理24 h后，G0/G1期細(xì)胞呈劑量依賴性的上升，當(dāng)PAC濃度為20 mg/L時，細(xì)胞周期G0/G1期百分比與對照組(46.3%)比較明顯增高(77.5%)(P<0.05)；S期細(xì)胞數(shù)明顯減少(18.3%，對照組為45.5%)。而當(dāng)PAC濃度為30 mg/L后，G0/G1期細(xì)胞百分率開始降低(50.2%)，S期逐漸升高(35.1%)。而40 mg/L的PAC作用HL-60細(xì)胞24 h，G2/M期細(xì)胞百分比明顯增高(22.4%)，并出現(xiàn)凋亡峰。

2.4PAC影響HL-60細(xì)胞表面分化抗原的表達(dá) 20 mg/L的PAC誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞24 h，流式細(xì)胞術(shù)檢測髓系較成熟階段細(xì)胞分化抗原CD14表達(dá)(15.78%)與對照組(0.33%)比較明顯增高(0.89% vs 0.31%)，CD11b表達(dá)稍增高，提示HL-60細(xì)胞向成熟階段細(xì)胞分化。

3 討 論

PAC是一類由葡萄、山楂、松樹皮、銀杏等植物中提取的多酚類聚合物。研究表明PAC能夠減輕腦出血大鼠的細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與PAC提高機(jī)體的抗氧化能力，同時增強(qiáng)抗凋亡基因bcl-2的表達(dá)，降低促凋亡基因bax 的表達(dá)有關(guān)〔4〕。PAC 可通過減輕腦水腫、改善腦組織的代謝障礙而對腦缺血發(fā)揮保護(hù)作用〔5〕。研究還表明PAC可以抑制消化道腫瘤、前列腺癌等多種腫瘤的生長，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡〔6，7〕，提示PAC有可能成為極有希望的低毒、高效的抗腫瘤藥物。但國內(nèi)外關(guān)于PAC對白血病細(xì)胞作用的研究報道極少。Hu等〔8〕研究表明低劑量GSPE(葡萄籽原花青素)可誘導(dǎo)人急性髓細(xì)胞白血病14.3D10細(xì)胞凋亡，但對人正常外周血細(xì)胞無影響，提示PAC在治療白血病方面具有一定的應(yīng)用前景。本研究結(jié)果表明PAC可劑量依賴性抑制細(xì)胞的增殖，隨著作用時間的延長，抑制率呈增高趨勢，但差異不明顯。提示PAC對HL-60細(xì)胞的生長增殖有抑制作用。Feng等〔9〕以花青素誘導(dǎo)氧化應(yīng)激殺傷白血病細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞雙染色檢測凋亡發(fā)現(xiàn)，當(dāng)花青素濃度為50 μg/ml，培養(yǎng)18 h后，HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡。本文PAC致HL-60細(xì)胞凋亡濃度與其比較偏低，但誘導(dǎo)時間延長，推測為實(shí)驗(yàn)室間培養(yǎng)或細(xì)胞株來源差異所致。陳夏靜等〔10〕用復(fù)方維甲酸注射液在誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化成熟過程中CD14表達(dá)增高。許培權(quán)等〔11〕用全反式維甲酸對HL-60細(xì)胞誘導(dǎo)分化中CD11b表達(dá)增高。本實(shí)驗(yàn)CD11b表達(dá)稍增高。國內(nèi)在利用誘導(dǎo)劑誘導(dǎo)白血病細(xì)胞分化研究多有CD11b表達(dá)增高，而Park等〔12〕則認(rèn)為CD11b是細(xì)胞黏附分子整合素家族成員之一，參與細(xì)胞的黏附與遷移，最早檢測到CD11b 是造血細(xì)胞發(fā)育過程中髓系祖細(xì)胞和原單核細(xì)胞階段，隨著進(jìn)一步分化，其表達(dá)逐漸減低。提示CD11b在白血病細(xì)胞中的表達(dá)尚不明確。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PAC能抑制HL-60細(xì)胞增殖，低濃度PAC能誘導(dǎo)其分化為較成熟階段細(xì)胞，隨濃度的增加分化效應(yīng)反而降低，高濃度PAC則可能誘導(dǎo)HL-60細(xì)胞發(fā)生凋亡。表明PAC對急性髓系HL-60細(xì)胞株具有雙效作用，其機(jī)制可能與細(xì)胞周期變化有關(guān)。

4 參考文獻(xiàn)

1謝朝陽，梅寒芳，祝其鋒，等.原花青素對Aβ25-35誘導(dǎo)PC12細(xì)胞周期紊亂的保護(hù)作用〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2009；29(10)：1197-200.

2Actis-Goretta L，Romanczyk LJ，Rodriguez CA，etal.Cytotoxic effects of digalloyl dimmer procyanidins in human caner cell lines〔J〕.J Nutr Biochem，2008；19(12)：797-808.

3Kim M，Wu X，Song I，etal.Selective cytotoxicity of synthesized procyanidin 3-O-galloylepicatechin-4b，8-3-O-galloylcatechin to human cancer cells〔J〕.Cell Cycle，2008；7(11)：1648-57.

4高 羽，董 志，徐 露.原花青素對實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠腦組織細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響〔J〕.中國藥理學(xué)通報，2010；26(7)：969-73.

5陳香紅，張 艷.原花青素對大鼠腦缺血再灌注損傷代謝障礙的影響〔J〕.中國實(shí)用神經(jīng)疾病雜志，2010；13(22)：15-7.

6Miura T，Chiba M，Kasai K，etal.Apple procyanidins induce tumor cell apoptosis through mitochondrial pathway activation of caspase-3〔J〕.Carcinogenesis，2008；29(3)：585-93.

7Kampa M，Theodoropoulou K，Mavromati F，etal.Novel oligomeric proan- thocyanidin derivatives interact with membrane androgen sites and induce regression of hormone-in-dependent prostate cancer〔J〕.J Pharmacol Exp Ther，2011；337(1)：24-32.

8Hu H，Qin YM.Grape seed proanthocyanidin extract induced mitochondria -associated apoptosis in human acute myeloid leukemia 14.3D cells〔J〕.Chin Med J(Engl),2006；119(5)：417-21.

9Feng R，Ni HM，Wang SY，etal.Cyanidin-3-rutinoside，a natural polyphenol antioxidant，selectively kills leukemic cells by induction of oxidative stress〔J〕.J Biol Chem，2007；282(18)：13468-76.

10陳夏靜，田 吉，何 兵，等.復(fù)方維甲酸注射液誘導(dǎo)K562分化及凋亡作用〔J〕.中藥藥理與臨床，2011；27(2)：64-7.

11許培權(quán)，龔建平.全反式維甲酸對HL-60細(xì)胞分化和凋亡的影響〔J〕.癌癥，2004；23(2)：118-23.

12Park H，Shelley CS，Arnaout MA.The zinc finger transcription factor ZBP-89 is a repressor of the human β2-integrin CD11b gene〔J〕.Blood，2003；101(3)：894-902.