趙 利 程青虹 曾建瓊 何永來 張忠雙 張海俊

(石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院ICU，新疆 石河子 832008)

膿毒癥發(fā)生率高、病死率高，成為重癥監(jiān)護病房內(nèi)非心臟病人死亡的主要原因〔1，2〕。肺組織有其防御機制，能夠緩解或抑制炎癥反應所致的肺損傷，其中血紅素加氧酶(HO)是組織細胞保護酶和抗氧化劑，能夠?qū)?nèi)毒素誘導的急性肺損傷動物模型起保護作用，臨床上以HO-1的表達量作為組織氧化應激水平的重要參考。本研究觀察烏司他丁(UTI)對膿毒癥早期肺損傷的保護作用以及治療后肺組織中HO-1表達的變化。

1 材料與方法

1.1實驗動物 120只雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量170～240 g，7～10周齡〔合格證號No.0014065,許可證號SYXK(粵),2003-0001〕。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.2實驗試劑 UTI注射液(天普洛安)：廣東天普生化醫(yī)藥股份有限公司，國藥準字H20040505，2011-11-08。氯化鈉注射液：中國大冢制藥有限公司，國藥準字H12020010，2010-09-30。10%水合氯醛：青島宇龍海藻有限公司，國藥準字H37022673。其他試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3方法

1.3.1分組 選取120只雄性Wistar大鼠隨機分為假手術組、膿毒癥組和UTI組各40只。膿毒癥組和UTI組采用盲腸結扎穿孔法(CLP)建模，假手術組，開腹后不做處理，僅縫合。

1.3.2建模 實驗前禁食12 h。給藥前，采用10%水合氯醛生理鹽水0.3 ml/100 g行舌靜脈注射進行全身麻醉。麻醉后，常規(guī)消毒皮膚，在無菌條件下開腹，作長為2 cm的切口，將盲腸移出腹腔，用絲線于回盲瓣和盲腸末端1/2處結扎盲腸根部。用9號注射針頭于盲腸端選取相距3 mm的點穿刺3處，在穿刺孔處輕微擠出糞渣1滴后逐層縫合腹腔，強力碘消毒包扎傷口，防止手術切口感染。術后給予大鼠皮下注射5 ml/100 g生理鹽水補充術中體液流失。觀察大鼠的存活情況，以72 h死亡率70%～80%作為理想的膿毒癥模型。UTI組：大鼠術后0、12、24 h給予舌下靜脈注射UTI 50 000 U/kg；假手術組和膿毒癥組在相同的時間點注射等量生理鹽水；各組給藥后，于6、12、24 h處死大鼠。

1.4考察指標 (1)采用蘇木素-伊紅(HE)染色法，取肺組織觀察其病理變化；采用HE將肺組織石蠟切片染色1.5 min后自來水沖洗1 min去除多余色素，用1%鹽酸乙醇分化7 s后自來水沖洗10 min，HE復染2 min，接著分別用70%、80%、90%、95%乙醇分化5 s，最后透明劑10 min。光學顯微鏡下觀察肺組織結構變化，并于圖像采集系統(tǒng)中隨機選取10個高倍(400×)視野圖片觀察結果。(2)Western 印跡法測定HO-1表達情況，以actin作為內(nèi)參照，以actin灰度值比值即為HO-1蛋白相對表達量。(3)采用Realtime PCR法測定HO-1 mRNA水平變化。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分離后掃描，用SD2.0軟件分析其Ct值，計算各標本平均Ct值，Ct=HO-1 Ct值-actin Ct值(Ct值越低，目的基因的相對表達量越高)，計算標準化后2-Ct值表示mRNA相對表達量。

2 結 果

2.1肺組織病理變化 術后6、12、24 h不同時間點，膿毒癥組較假手術組在肺出血、肺水腫、肺泡間隔、炎性細胞浸潤等病理上，變化越來越顯著。而經(jīng)過UTI作用，UTI組其肺組織病理變化較膿毒癥組明顯減輕。見圖1。

2.2Western 印跡法觀察肺組織HO-1蛋白 術后6、12、24 h各時間點HO-1蛋白表達膿毒癥組較假手術組均增多，于12 h和24 h UTI組較膿毒癥組表達減少(P<0.05)。見表1，圖2。

2.3Realtime PCR法觀察肺組織HO-1水平變化 術后6、12、24 h各時間點UTI組、膿毒癥組HO-1 mRNA的表達均多于假手術組；術后12、24 h，UTI組HO-1mRNA水平明顯低于膿毒癥組(P<0.05)。見圖3。

圖1 肺組織病理變化(HE染色,×200)

表1 各組在不同時間點HO-1蛋白表達

圖2 肺組織HO-1蛋白的表達

圖3 HO-1 mRNA水平變化

3 討 論

CLP建模是有效模擬與臨床相關的膿毒癥模型的有效方法，可模擬出臨床患者的肺內(nèi)病理改變以及內(nèi)源性多細菌感染〔4〕。膿毒癥是全身的炎癥反應，常見于危重術后并發(fā)癥，甚至可致危重患者死亡〔5〕。HO是血紅素分解代謝過程中的限速酶，因為環(huán)境、各式細胞壓力的催化或其他結構無關的藥物等因素催化，HO-1的表達量會有所增加。此外，若有物理或者化學性的刺激，HO-1基因會因組織和細胞的誘導發(fā)生編碼、轉(zhuǎn)錄，從而導致HO-1蛋白水平升高。結合近年來的研究〔6〕，對HO-1抵抗細菌性膿毒癥的機制有所發(fā)現(xiàn)?，F(xiàn)有研究〔7,8〕表明，HO-1在肺缺血再灌肺損傷、呼吸機相關性肺損傷的模型中，其表達均有上升，對肺靶器官有保護作用。在本實驗中，觀察到假手術組肺組織結構完整，未出現(xiàn)肺組織水腫、紅細胞浸潤和炎性細胞等，肺泡間隔也并無增厚。膿毒癥組肺組織結構不連貫，有間斷，可觀察到肺泡腔內(nèi)有紅細胞和炎性細胞，出現(xiàn)肺泡間隔增厚以及肺組織腫脹。在術后6 h，UTI組存在上述病理變化，且病理水平一致，但隨著時間延長，UTI組較膿毒癥組明顯減輕，可推測UTI對膿毒癥早期肺損傷有保護作用。

此外，大量研究〔9〕表明，HO-1/膽紅素/CO共同組成了機體不可缺少的內(nèi)源性保護系統(tǒng)，廣泛參與多種急慢性氧化應激損傷，在多種疾病中起重要作用。HO-1基因缺乏可導致心、肺、腎、腦等多種疾病的損失，增加死亡率，反之，人為調(diào)高HO-1表達可有效增強組織和細胞抗損傷的能力〔10〕。本結果顯示UTI能明顯提高肺損傷大鼠HO-1 mRNA和蛋白在肺組織中的表達，由此推測UTI是通過提高HO-1表達而發(fā)揮抗氧化損傷的作用，這也可能是UTI治療膿毒癥肺損傷的機制之一。

UTI系從人尿提取精制的糖蛋白，屬蛋白酶抑制劑。能夠通過抑制胰蛋白酶等各種胰酶活性作用，改善手術刺激引起的免疫功能下降、蛋白代謝異常和腎功能降低，有效防止手術刺激引起的對內(nèi)臟器官與細胞的損傷以及改善休克時的循環(huán)狀態(tài)等〔11〕。其作用機制是通過抑制粒細胞彈性蛋白酶、胰蛋白酶和α-糜蛋白酶等的活性，從而促進酶降解〔12,13〕。UTI對腎臟、肝臟和肺的功能有保護作用〔14〕，現(xiàn)已廣泛應用于臨床上各種休克及大手術時的臟器功能保護，或者輔助治療急診嚴重膿毒癥患者〔15〕。結合本研究結果，UTI對膿毒癥肺損傷大鼠確有保護作用。

以往研究〔16〕中，常采用預先給藥以研究藥物對膿毒癥肺損傷的保護作用，即在建模前給藥，明顯該方法與臨床實際情況不符。臨床上都是在患者發(fā)病后采取措施，因此本研究從實際情況出發(fā)，在發(fā)病初期予以UTI處理，以更接近臨床狀況。本實驗的結果表明，肺組織中HO-1的產(chǎn)生可提示膿毒癥引起的肺損傷，氧化應激水平可通過UTI抑制炎癥因子而改善,間接上調(diào)HO-1的表達,為膿毒癥時對大鼠的肺損傷起保護作用。

4 參考文獻

1趙永禎,李春盛.急診膿毒癥病死率評分在急診膿毒癥患者中的應用〔J〕.中華急診醫(yī)學雜志,2011;20(8):797-802.

2Annane D,Bellissan E,Bollaert PE,etal. Corticosteroids in the treatment of severe sepsis and septic shock in adults：a systematic review〔J〕. JAMA,2009;301(22):2362-75.

3王桂禎，王 璽，林兆奮.盲腸結扎穿孔法膿毒癥大鼠的骨骼肌蛋白代謝規(guī)律研究〔J〕.外科理論與實踐，2012;17(6)：654-8.

4Snelgrove RJ.Pulmonary innate lymphoid cells regulate repair and remodeling after acute lung injury〔J〕.Expert Rev Anti Infect Ther,2012;10(3):281-4.

5馬春燕，陳 麗.氯胺酮對膿毒癥大鼠肺組織HO-1表達的影響〔J〕.中國醫(yī)療前沿，2011;6(22)：15-6.

6王 劍，卿國忠，楊少俊.烏司他丁對急性肺損傷大鼠肺組織HO-1表達的影響〔J〕.當代醫(yī)學，2012;18(25)：10-2.

7王 軍.烏司他丁對急性百草枯中毒肺損傷患者血清炎性因子水平的影響〔J〕.山東醫(yī)藥,2011;51(31):62-3.

8胡偉偉,趙文靜.大鼠血紅素加氧酶-1表達對呼吸機相關性肺損傷時SOD、MDA的影響〔J〕.徐州醫(yī)學院學報,2010;30(5):281-4.

9Ryter SW，Choi AM.Heme oxygenase-1/carbon monoxide：novel therapeutic strategies in critical care medicine〔J〕.Curr Drug Targets,2010;11(12)：1485-194.

10Nussler AK，Hao L，Knobeloch D，etal.Protective role of HO-1 for alcohol-dependent liver damage〔J〕.Dig Dis,2010;28(6)：792-8.

11雷 明.烏司他丁對重癥膿毒癥患者的療效和安全性分析〔J〕.白求恩軍醫(yī)學院學報,2012;10(4):299-300.

12安 宇,何敬遠,王義興,等.烏司他丁聯(lián)合血必凈治療重癥膿毒癥的研究〔J〕.現(xiàn)代生物醫(yī)學進展,2011;11(15):2898-900.

13劉淑紅，崔朝勃，王 晶，等.烏司他丁治療重癥肺炎的臨床研究〔J〕.中國急救醫(yī)學，2010;30(6)：508-11.

14蔡 毅，林建東.烏司他丁對膿毒癥臟器的保護作用〔J〕，醫(yī)學綜述，2010;16(2)：286-8.

15宋 維，歐陽艷紅，劉元稅，等.烏司他丁對急診膿毒癥患者的器官保護作用〔J〕.海南醫(yī)學，2011;22(23)：72-4.

16許 平,白慶梅.烏司他丁對急性肺損傷的保護作用〔J〕.中國現(xiàn)代藥物應用,2010;4(8):46.