胡若愚，承燕，李好，張雷，景華，吳海衛(wèi)

(南京大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 南京軍區(qū)南京總醫(yī)院 心胸外科，江蘇 南京 210002)

血液循環(huán)是機(jī)體生命維持的重要保證。血管內(nèi)皮作為血液與周圍組織的分界，在血液循環(huán)的穩(wěn)定性的維持中起著非常重要的作用[1]。自1997年Asahara首次報(bào)道經(jīng)由外周血獲得內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cell，EPC)以來(lái)，EPC因其具有的強(qiáng)大增殖潛能及向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化的特性，越來(lái)越引起廣大醫(yī)學(xué)科研工作者的重視[2]。研究表明，EPC作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，不僅有著強(qiáng)大的增殖及分化能力，更具備向缺血或受損組織遷移、歸巢的特性，在血管新生及內(nèi)皮修復(fù)中起著獨(dú)特而關(guān)鍵的作用。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，EPC不僅是冠心病發(fā)病預(yù)測(cè)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，更在心肌梗死后的血管新生中發(fā)揮重要作用[3- 4]；利用EPC移植治療冠心病及心肌梗死也取得了良好的效果[5]；利用EPC治療肢體缺血的試驗(yàn)研究顯示出EPC具有強(qiáng)大的促血管新生能力，能夠明顯地促進(jìn)閉塞血管周圍組織內(nèi)的血管新生[6- 7]。與此同時(shí)，由于生理狀態(tài)下循環(huán)血液中的EPC含量極低，僅占外周血中有核細(xì)胞數(shù)量的0.01%～0.02%[8]，而在冠心病、吸煙人群、糖尿病、老齡人等特定人群中，循環(huán)血中的EPC數(shù)量會(huì)進(jìn)一步降低[9- 11]。因此，當(dāng)心肌梗死等突發(fā)疾病發(fā)生時(shí)，患者自體外周血中的EPC數(shù)量往往不能在第一時(shí)間滿足血管修復(fù)及再生的需要。因此，通過(guò)體外培養(yǎng)及擴(kuò)增的方法預(yù)先獲得充足的EPC，并在疾病發(fā)生后迅速予以患者輸入外源性EPC應(yīng)當(dāng)是EPC治療的重要方法乃至必由之路。

EPC的獲取來(lái)源及培養(yǎng)方法各家報(bào)道不一，而自骨髓提取骨髓單核細(xì)胞接種進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)是目前國(guó)外研究所廣泛采用的主流培養(yǎng)方法。該方法穩(wěn)定、高效、經(jīng)濟(jì)，且能有效避免細(xì)胞獲取過(guò)程中的細(xì)胞污染。特別是在小鼠等外周血量極少的小動(dòng)物研究中，更具有其獨(dú)特的可操作性。本研究采用BALB/c小鼠骨髓獲得單核細(xì)胞，分離培養(yǎng)并鑒定骨髓來(lái)源的小鼠EPC，為今后EPC的細(xì)胞學(xué)治療研究奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及主要儀器

BALB/c小鼠(雄性，5～7周齡，體重21～25 g·只-1，由南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供)；EGM- 2 SingleQuots培養(yǎng)基(美國(guó)Lonza公司)；人纖維連接蛋白 (美國(guó)R&D公司)；小鼠淋巴細(xì)胞分離液 (美國(guó)Sigma- Aldrich公司)；大鼠抗小鼠CD34單克隆抗體、兔抗小鼠VEGFR2多克隆抗體(均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司)；羊抗大鼠IgG- FITC抗體、羊抗兔IgG- PE抗體(均購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司);DiI- Ac- LDL(美國(guó)Invitrogen公司);FITC- UEA- 1(美國(guó)Sigma- Aldrich公司);抗小鼠 CD34- FITC流式抗體、抗小鼠VEGFR2- PE流式抗體、大鼠IgG2aK- PE 同型對(duì)照流式抗體、大鼠IgG2aK- FITC同型對(duì)照流式抗體 (均購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司)。超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán))，細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)，水平離心機(jī)(上海醫(yī)用分析儀器廠)，流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)，熒光倒置顯微鏡(日本Olympus IX71型)。

1.2 小鼠骨髓源性EPC的分離與培養(yǎng)

每次取雄性BALB/c小鼠6只，麻醉后推頭法迅速處死并置入75%酒精中浸泡30 min。于超凈工作臺(tái)上將小鼠雙下肢股骨、脛骨分離并取出，浸泡于含胎牛血清的PBS溶液中保存。以1 ml注射器及PBS沖洗小鼠脛、股骨骨髓腔，沖洗獲得的骨髓細(xì)胞懸液收集于15 ml離心管中。每次沖洗PBS液量為6 ml。將4 ml小鼠淋巴細(xì)胞分離液加入離心管底部，并將獲得的骨髓細(xì)胞懸液沿離心管壁緩慢加入離心管中。將該離心管于水平離心機(jī)中離心，以2 500 r·min-1離心30 min。離心后可觀察到離心管內(nèi)液體分為3層：底層為紅細(xì)胞層；中層可觀察到約2～3 mm厚的白膜層，此即為單核細(xì)胞層；上層為血清層。以無(wú)菌吸管將白膜層吸出，以無(wú)菌PBS液洗滌所獲細(xì)胞2次，并以1 ml EGM- 2 SingleQuots培養(yǎng)液定容、混勻，制成母液。細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，以5×106孔-1細(xì)胞量將細(xì)胞接種于人纖維連接蛋白包被的6孔培養(yǎng)板中，每孔內(nèi)培養(yǎng)液為2 ml。將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞接種后第4天首次更換細(xì)胞培養(yǎng)液，棄去未貼壁細(xì)胞，將貼壁細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)。此后每2 d更換培養(yǎng)液1次。細(xì)胞培養(yǎng)3周，每日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，并拍照留存。

1.3 小鼠EPC的鑒定

1.3.1 細(xì)胞表面抗原免疫熒光法鑒定 選用培養(yǎng)至第21天的EPC行細(xì)胞表面抗原免疫熒光法鑒定，方法如下：(1) 細(xì)胞接種前于細(xì)胞培養(yǎng)板各孔內(nèi)投入1 cm×1 cm無(wú)菌載玻片1枚，并行人纖維連接蛋白包被。細(xì)胞接種時(shí)，將細(xì)胞懸液滴加于載玻片上，并輕輕搖勻，使細(xì)胞于孔內(nèi)均勻分布。細(xì)胞培養(yǎng)方法同前。(2) 細(xì)胞培養(yǎng)至21 d后取出載玻片，并以用4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂洗3次，山羊封閉血清作用30 min，分別加入大鼠抗小鼠CD34單克隆抗體(1∶50)及兔抗小鼠VEGFR2多克隆抗體(1∶100),并于4 ℃孵育過(guò)夜。次日，以PBS漂洗3次后，加入羊抗大鼠IgG- FITC抗體(1∶200)及羊抗兔IgG- PE抗體(1∶500)，常溫下孵育1 h。(3) PBS漂洗2遍后，以10%緩沖甘油封片。于熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞CD34及VEGFR2表達(dá)情況。

1.3.2 細(xì)胞表面抗原流式細(xì)胞儀檢測(cè) 選擇培養(yǎng)至第21天的EPC行流式細(xì)胞儀檢測(cè)，具體方法如下：(1) 吸去細(xì)胞培養(yǎng)液，并以PBS洗滌細(xì)胞2遍，以充分去除培養(yǎng)液及死亡的懸浮細(xì)胞。(2) 選用不含EDTA的0.25%胰酶消化細(xì)胞后收集并用血清中和。(3) 離心并以PBS洗滌細(xì)胞2次，細(xì)胞重懸后計(jì)數(shù)并收集5×105細(xì)胞待檢，加入抗小鼠CD34- FITC、VEGFR2- PE流式抗體各10 μl。常溫下避光孵育1 h。(4) 1 h后再次離心，棄去上清，并以500 μl PBS重懸細(xì)胞后上機(jī)檢測(cè)。流式細(xì)胞檢測(cè)定標(biāo)采用同型對(duì)照抗體標(biāo)記細(xì)胞，方法同上。

1.3.3 細(xì)胞功能檢測(cè) 選用培養(yǎng)第21天的EPC行細(xì)胞功能檢測(cè)，具體方法如下：(1) 細(xì)胞爬片及培養(yǎng)方法同前。(2) 培養(yǎng)21 d后取出載玻片，將1 ml含10 μg·ml-1DiI- ac- LDL 的EGM- 2 SingleQuots培養(yǎng)液加入培養(yǎng)孔中，并于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育 2 h。(3) 2 h后取出培養(yǎng)板，并以PBS洗滌載玻片2次，4%多聚甲醛固定30 min。再次以PBS洗滌載玻片2次。并加入FITC標(biāo)記的荊豆凝集素2 ml，F(xiàn)ITC- UEA- 1濃度為10 μg·ml-1，常溫下孵育1 h。(4) 1 h后取出載玻片， PBS洗滌2遍后10%緩沖甘油封片。(5) 熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞吞噬DiI- ac- LDL及結(jié)合FITC- UEA- 1情況并拍攝照片。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞形態(tài)

骨髓單核細(xì)胞接種于細(xì)胞培養(yǎng)板上，起初為密集的小圓形細(xì)胞(圖1A)。48 h可觀察到細(xì)胞開始變大。接種第4天行首次更換培養(yǎng)液后，將培養(yǎng)板內(nèi)絕大多數(shù)未貼壁細(xì)胞去除。貼壁細(xì)胞開始逐漸出現(xiàn)加速生長(zhǎng)趨勢(shì)，細(xì)胞向梭型細(xì)胞轉(zhuǎn)變，細(xì)胞體積進(jìn)一步增大。細(xì)胞接種后第7天左右，培養(yǎng)板內(nèi)可觀察到多個(gè)細(xì)胞集落出現(xiàn)。細(xì)胞集落形態(tài)為：中間小圓形細(xì)胞聚集成團(tuán)，周圍長(zhǎng)梭型細(xì)胞呈放射狀排列(圖1B)。此后，細(xì)胞集落生長(zhǎng)速度進(jìn)一步增快，集落數(shù)量也逐漸增多，集落周邊細(xì)胞也逐漸由長(zhǎng)梭型向短梭形轉(zhuǎn)變。在此期間，可觀察到部分細(xì)胞排列出現(xiàn)極性，呈現(xiàn)管狀(圖1C)、網(wǎng)狀樣(圖1D)生長(zhǎng)，提示EPC具有成血管特性。培養(yǎng)至2周后，細(xì)胞集落逐漸消失，細(xì)胞形態(tài)趨于均一，呈現(xiàn)“鋪路石”樣生長(zhǎng)狀態(tài)(圖1E)。

2.2 免疫熒光檢測(cè)

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)至3周后細(xì)胞絕大多數(shù)能被CD34及VEGFR2同時(shí)標(biāo)記。熒光顯微鏡下可見(jiàn)CD34標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞呈綠色熒光，VEGFR2標(biāo)記陽(yáng)性細(xì)胞呈紅色熒光。通過(guò)于同一視野下分別拍攝熒光照片并以Image Pro Plus軟件合成雙色熒光，可見(jiàn)共表達(dá)CD34及VEGFR2細(xì)胞呈現(xiàn)橙色，提示該細(xì)胞即為EPC(圖2)。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測(cè)

本研究采用流式細(xì)胞儀計(jì)量培養(yǎng)細(xì)胞中共表達(dá)CD34及VEGFR2細(xì)胞比例。根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，本研究所培養(yǎng)至3周后的細(xì)胞中，CD34及VEGFR2雙陽(yáng)性細(xì)胞比例均占培養(yǎng)細(xì)胞總量的85%以上，提示檢測(cè)細(xì)胞絕大多數(shù)為EPC (圖3)。

A.骨髓單核細(xì)胞接種于人纖維連接蛋白包被的培養(yǎng)板中；B.細(xì)胞培養(yǎng)第7天出現(xiàn)細(xì)胞集落(箭頭所指)；C.培養(yǎng)期間，部分細(xì)胞呈現(xiàn)管狀生長(zhǎng)(箭頭所指);D. 細(xì)胞呈網(wǎng)狀樣生長(zhǎng)(箭頭所指為網(wǎng)狀樣生長(zhǎng)的EPC，圖中心箭頭所指為EPC細(xì)胞集落)；E.培養(yǎng)至2周后，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)“鋪路石”樣生長(zhǎng)狀態(tài)

圖1細(xì)胞形態(tài)

A. Bone marrow mononuclear cells were seeded in the human fibronectin- coated flasks; B. Colony forming unit appeared since the 7thday of culture(arrow); C. During the cell culture， EPC were found arranging in a tube- like(arrow); D. EPC were net- like(arrow indicated the EPC network， figure center arrow indicated the EPC cell forming unit); E. EPC gradually changed to a cobblestone- like morphology after 2 weeks of culture．

Fig1Cellmorphology

2.4 細(xì)胞功能檢測(cè)

EPC具備吞噬乙?；兔芏戎鞍啄芰敖Y(jié)合荊豆凝集素能力。本研究結(jié)果顯示,所培養(yǎng)的細(xì)胞絕大多數(shù)具備吞噬DiI- Ac- LDL及結(jié)合FITC- UEA- 1能力。熒光顯微鏡下可見(jiàn)，吞噬DiI- Ac- LDL的EPC胞漿內(nèi)呈現(xiàn)紅色熒光，結(jié)合FITC- UEA- 1的EPC細(xì)胞膜呈現(xiàn)綠色熒光。通過(guò)于同一視野下分別拍攝熒光照片并以Image Pro Plus軟件合成熒光染色照片，可見(jiàn)雙陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)橙色熒光，提示該細(xì)胞即為EPC(圖4)。

3 討 論

EPC是一類可以分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，由中胚層的成血管母細(xì)胞分化而來(lái)。EPC不僅參與人體胚胎血管形成，同時(shí)也參與出生后血管形成、再內(nèi)皮化和機(jī)體血管損傷后的修復(fù)過(guò)程[12- 13]。隨著研究的不斷進(jìn)展，科研工作者相繼從骨髓、臍血、胚胎肝臟及外周血中分離并提取出EPC。其中，骨髓中EPC含量最高，為外周血中的15倍[14- 15]。因此，自骨髓中提取EPC是一種更加簡(jiǎn)便、高效的細(xì)胞提取方法。特別是對(duì)諸如小鼠等外周血量極少的小動(dòng)物，從骨髓細(xì)胞中分離獲取單核細(xì)胞并誘導(dǎo)分化為EPC的細(xì)胞培養(yǎng)方法有著其他方法不可比擬的優(yōu)勢(shì)。在本次實(shí)驗(yàn)中，我們選擇了自骨髓單核細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)EPC的方法。通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究我們發(fā)現(xiàn)，該方法簡(jiǎn)便、高效、易行。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)：自每只小鼠雙下肢股骨、腓骨骨髓中可獲得的單核細(xì)胞數(shù)量大約為1×107個(gè)左右。完全可以滿足細(xì)胞接種及培養(yǎng)需要。我們還發(fā)現(xiàn)：選擇5～7周齡的小鼠進(jìn)行骨髓細(xì)胞提取，可以獲得更多的骨髓單核細(xì)胞，過(guò)老或過(guò)小的小鼠，骨髓單核細(xì)胞提取效率則相對(duì)較低。有研究表明：人纖維連接蛋白能夠促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)及增殖。因此，在我們的實(shí)驗(yàn)中也采用了預(yù)先使用人纖維連接蛋白進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)板包被的方法。通過(guò)比較我們發(fā)現(xiàn)：通過(guò)使用人纖維連接蛋白進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)板包被能有效地提高細(xì)胞的黏附效率，并能有力地促進(jìn)細(xì)胞增殖及細(xì)胞集落的形成[16]。

共表達(dá)CD34及VEGFR2細(xì)胞呈現(xiàn)橙色，提示該細(xì)胞即為EPC

圖2CD34、VEGFR2雙陽(yáng)性免疫熒光染色

Cells co- expressing CD34 and VEGFR2 exhibited orange fluoresce-nce and were considered as EPC

Fig2ImmunofluorescencestainingofCD34andVEGFR2

細(xì)胞培養(yǎng)至3周后，CD34及VEGFR2雙陽(yáng)性細(xì)胞比例均占培養(yǎng)細(xì)胞總量的85%以上

圖3CD34、VEGFR2流式細(xì)胞儀檢測(cè)

Over 85% of sample cells cultured over 3 weeks co- expressed CD34 and VEGFR2

Fig3CD34andVEGFR2flowcytometerdetermination

DiI、FITC雙陽(yáng)性細(xì)胞呈現(xiàn)橙色熒光，提示該細(xì)胞即為EPC

圖4EPC吞噬DiI-Ac-LDL及結(jié)合FITC-UEA-lectin檢測(cè)

Cells double positive for DiI and FITC showed orange fluorescence were considered as EPC

Fig4DeterminationofDiI-Ac-LDLuptakeandFITC-UEA-LectinbindingofculturedEPC

關(guān)于EPC的培養(yǎng)方法各類文獻(xiàn)報(bào)道不一，其主要區(qū)別在于單核細(xì)胞接種后，培養(yǎng)未貼壁細(xì)胞還是貼壁細(xì)胞。Prater等回顧分析了2種細(xì)胞培養(yǎng)方法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩種方法均可培養(yǎng)獲得EPC。但其區(qū)別在于將早期未貼壁細(xì)胞留取，進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)所獲得的細(xì)胞與Asahara所報(bào)道的相似，為中央圓形細(xì)胞聚集，周圍為梭型細(xì)胞，并呈放射狀分布，該類細(xì)胞目前又被稱為colony forming unit- EC(CFU- EC)或早期內(nèi)皮祖細(xì)胞(early- EPC)；而棄去早期未貼壁細(xì)胞，而將貼壁細(xì)胞留取培養(yǎng)，所獲得的細(xì)胞呈現(xiàn)“鋪路石樣”外觀，此類細(xì)胞目前又被稱為endothelial colony forming cell(ECFC)或晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞(late- EPC)[17]。而根據(jù)Hur等進(jìn)行的針對(duì)這兩類細(xì)胞的研究表明，早期EPC出現(xiàn)在細(xì)胞培養(yǎng)的第2～3周，第4周左右消失，細(xì)胞形態(tài)為梭形；晚期EPC在細(xì)胞第4～8周左右出現(xiàn)，并可生長(zhǎng)至第12周左右，細(xì)胞集落呈現(xiàn)“鋪路石”樣形態(tài)[18]。研究還表明：晚期EPC在細(xì)胞增殖能力、成血管能力及對(duì)受損內(nèi)皮細(xì)胞的修復(fù)能力上，均較早期EPC有顯著提高。而關(guān)于兩類EPC亞型之間的關(guān)系及來(lái)源，目前各種報(bào)道觀點(diǎn)不一，甚至有觀點(diǎn)認(rèn)為兩類EPC是由兩種不同細(xì)胞分化而來(lái)[19]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)所培養(yǎng)的細(xì)胞先后出現(xiàn)了早期及晚期EPC的細(xì)胞形態(tài)，該現(xiàn)象提示我們：晚期EPC很可能是由早期EPC演化而來(lái)，而并不是一類單獨(dú)的細(xì)胞來(lái)源。

EPC的鑒定目前仍然缺乏獲得廣泛公認(rèn)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。根據(jù)目前已有文獻(xiàn)報(bào)道和研究所普遍采用的鑒定方法，認(rèn)為EPC的鑒定應(yīng)包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)鑒定、細(xì)胞表面抗原鑒定及細(xì)胞功能測(cè)定。EPC的早期及晚期的形態(tài)學(xué)特征差異較大。值得注意的是，我們?cè)谂囵B(yǎng)過(guò)程中，多次發(fā)現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)出現(xiàn)極性排列現(xiàn)象，特別是出現(xiàn)細(xì)胞首尾相接并呈現(xiàn)管狀生長(zhǎng)，以及由一個(gè)大的細(xì)胞集落生發(fā)出網(wǎng)狀排列細(xì)胞的生長(zhǎng)現(xiàn)象。這些現(xiàn)象在其他細(xì)胞培養(yǎng)中尚屬少見(jiàn)，更加強(qiáng)烈地顯示出EPC作為血管內(nèi)皮細(xì)胞的成血管特性。同時(shí)，我們還發(fā)現(xiàn)：EPC的增殖能力極強(qiáng)，特別是生長(zhǎng)至2周左右之后，其增殖加速現(xiàn)象格外明顯，提示EPC具有遲發(fā)型高增殖能力。有報(bào)道表明，EPC的增殖能力是內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的50倍左右[20]。關(guān)于EPC的細(xì)胞表面標(biāo)志的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，目前各家觀點(diǎn)不一。根據(jù)Asahara等的首次報(bào)道，認(rèn)為EPC應(yīng)同時(shí)表達(dá)CD34、CD133及VEGFR2。早期EPC還表達(dá)白細(xì)胞通用抗原CD45。但隨著研究的不斷深入，目前觀點(diǎn)認(rèn)為，EPC的細(xì)胞表面標(biāo)志是一個(gè)動(dòng)態(tài)變化過(guò)程，隨著EPC向內(nèi)皮細(xì)胞逐漸分化，干細(xì)胞標(biāo)志物CD133及白細(xì)胞標(biāo)志物CD45表達(dá)會(huì)逐漸降低以致丟失。由于EPC是由造血干細(xì)胞分化而來(lái)，目前觀點(diǎn)認(rèn)為，EPC應(yīng)至少表達(dá)一個(gè)造血干細(xì)胞標(biāo)記物CD34及反應(yīng)內(nèi)皮細(xì)胞特征的細(xì)胞標(biāo)記物VEGFR2或CD31[16]。而Schmidt- lucke等提出的鑒定外周血中EPC的流式細(xì)胞鑒定方法也將CD45弱陽(yáng)性、CD34、VEGFR2雙陽(yáng)性作為定義EPC的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)[8]。在本次研究中，我們也選用CD34與VEGFR2雙陽(yáng)性表達(dá)鑒定培養(yǎng)獲得的EPC。根據(jù)免疫熒光及流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，超過(guò)85%的細(xì)胞共表達(dá)上述兩抗原。提示所培養(yǎng)細(xì)胞確為EPC。關(guān)于EPC功能的檢測(cè)，目前主流的檢測(cè)方法為測(cè)定EPC吞噬乙酰化低密度脂蛋白及結(jié)合荊豆凝集素能力。該檢測(cè)方法曾被廣泛采用，甚至有研究?jī)H使用該方法進(jìn)行EPC鑒定[21]。隨著對(duì)EPC研究的發(fā)展及認(rèn)識(shí)的深入，科研工作者發(fā)現(xiàn)，該功能并非EPC所特有，其他細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞也具有此類功能。因此，該檢測(cè)方法只能作為EPC鑒定的輔助手段，而完全依賴該方法進(jìn)行EPC鑒定顯然不夠嚴(yán)謹(jǐn)。

綜上所述，通過(guò)本項(xiàng)研究，我們確立了一套自通過(guò)分離小鼠骨髓單核細(xì)胞進(jìn)行EPC誘導(dǎo)培養(yǎng)的培養(yǎng)方法。并通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、細(xì)胞表面抗原測(cè)定及細(xì)胞功能檢測(cè)3方面確定我們所培養(yǎng)的細(xì)胞為EPC,為今后利用EPC進(jìn)行相關(guān)科學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

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