齊斌，任威，李春江，張銳

(中國人民解放軍第202醫(yī)院 心血管內(nèi)科， 遼寧 沈陽 110003)

已有研究[1]顯示，心肌梗死的發(fā)生與炎癥反應(yīng)相關(guān)。炎癥反應(yīng)是組織能夠愈合的條件，但同時(shí)也能引起組織的進(jìn)一步損傷，影響心室重塑，導(dǎo)致心肌梗死和心肌功能的下降[2]。越來越多的證據(jù)表明，心肌組織損傷反應(yīng)與先天免疫系統(tǒng)相關(guān)，包括多種受體家族。目前研究較多的是Toll樣受體家族，它能夠識別微生物來源的保守序列。

NLP家族pyrin結(jié)構(gòu)域3(NLRP3)是細(xì)胞質(zhì)識別受體，通過形成復(fù)合體調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)和炎癥。NLRP3炎癥體是多蛋白復(fù)合體，它能夠活化炎癥細(xì)胞因子白介素1β(IL- 1β)和白介素18(IL- 18)的前體?；罨腘LRP3炎癥體也能夠誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[3]。我們對心肌缺血缺氧狀態(tài)下NLRP3在心肌成纖維細(xì)胞中的表達(dá)作一觀察，為心肌梗死及心肌缺血的診斷和治療提供分子理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑

Wistar大鼠購自中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，抗NLRP3抗體和氯化鈷購于Sigma公司，Trizol試劑和引物合成購于Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄和Real- time PCR試劑盒購于TaKaRa公司，二抗購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，DMEM培養(yǎng)基和血清購于Hyclone公司。

1.2 大鼠心肌成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)

予5%異氟醚氣體將Wistar大鼠麻醉，摘除心臟，用無鈣離子的Tyrode氏液逆行灌注，Ⅱ型膠原酶酶解心肌細(xì)胞。分離大鼠的心肌成纖維細(xì)胞，進(jìn)行體外培養(yǎng)。

1.3 大鼠心肌成纖維細(xì)胞缺氧誘導(dǎo)

將體外培養(yǎng)的原代大鼠心肌成纖維細(xì)胞分成兩組：實(shí)驗(yàn)組加入100 μmol·L-1氯化鈷或在5%低氧孵箱中培養(yǎng)，模擬缺氧的細(xì)胞生存環(huán)境；對照組采用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)。24 h后收集細(xì)胞。5%低氧孵箱是充入氮?dú)獾募?xì)胞培養(yǎng)孵箱，能夠?qū)⒀鯕夂靠刂圃?%，對細(xì)胞進(jìn)行低氧培養(yǎng)。

1.4 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄

收集兩組大鼠心肌成纖維細(xì)胞，用Trizol提取總RNA，操作步驟按照Invitrogen公司Trizol說明書進(jìn)行。紫外分光光度計(jì)測定RNA純度并定量。取500 ng的總

RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA，操作步驟按照TaKaRa公司反轉(zhuǎn)錄說明書進(jìn)行。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測NLRP3表達(dá)

利用安捷倫Mx3000PTMReal- time PCR系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增，操作步驟按照TaKaRa公司SYBR Green I試劑盒進(jìn)行操作。以實(shí)驗(yàn)組和對照組的cDNA為模版，擴(kuò)增引物為NLRP3F:5′- GAG TTC TTC GCT GCT ATG T- 3′；NLRP3R:5′- ACC TTC ACG TCT CGG TTC- 3′;ActinF:5′- TCA CCA ACT GGG ACG ACA- 3′；ActinR:5′- ACA GCA CCG CCT GGA TAG- 3′。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次進(jìn)行3復(fù)孔檢測。

1.6 Western blot檢測NLRP3表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組和對照組心肌成纖維細(xì)胞中加入100 μl含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上孵育裂解細(xì)胞，低溫下13 000×g離心15 min。取上清進(jìn)行蛋白定量。經(jīng)10% SDS- PAGE凝膠分離，恒壓轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。將PVD下膜用anti- NLRP3抗體(1∶500稀釋)進(jìn)行在4 ℃條件孵育過夜。再用辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔(1∶5 000稀釋) 二抗常溫孵育2 h。ECL發(fā)光顯影。將膜stripping后，重新封閉，加入內(nèi)參β- actin抗體(1∶6 000， 北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)作為對照[4]。本實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

2 結(jié) 果

2.1 NLRP3基因表達(dá)水平

經(jīng)過Real- time PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在氯化鈷和低氧培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組中NLRP3基因表達(dá)明顯高于對照組。見圖1。

圖1Real-timePCR檢測NLRP3基因在氯化鈷(A)和5%的低氧(B)條件下的表達(dá)

Fig1Real-timePCRanalysisshowsthegeneexpressionofNLRP3incontrolgroupandCoCl2(A)or5%hypoxia(B)group

2.2 NLRP3蛋白質(zhì)表達(dá)水平

Western blot實(shí)驗(yàn)檢測在氯化鈷和低氧培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)組中,NLRP3蛋白質(zhì)表達(dá)明顯高于對照組。見圖2。

3 討 論

NLRP3基因定位于1號染色體長臂上，是由pyrin樣蛋白所編碼，包括pyrin樣結(jié)構(gòu)域、核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域及亮氨酸富含重復(fù)基序。它能與含有pyrin結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白CARD結(jié)合[5]，CARD蛋白與炎癥和免疫反應(yīng)相關(guān)。NLRP3蛋白可能是NF-κB信號通路的活化因子[6]。

圖2Westernblotting檢測NLRP3蛋白在氯化鈷(A)和5%的低氧(B)條件下的表達(dá)

Fig2WesternblotanalysisshowstheproteinlevelofNLRP3incontrolgroupandCoCl2(A)or5%hypoxia(B)group

NLRP3炎癥小體是多蛋白復(fù)合體，NLRP3能夠通過活化細(xì)胞因子白介素前體引起促炎因子過度表達(dá)，導(dǎo)致慢性炎癥和自身免疫疾病。NLRP3能夠被很多刺激因素激活，包括細(xì)菌、病毒、真菌、死細(xì)胞復(fù)合物及晶體顆粒等。炎癥小體的活化對于病源清除和免疫應(yīng)答誘導(dǎo)起著重要作用[7]，而NLRP3炎癥小體活性失調(diào)能夠引起多種疾病的發(fā)生，包括冷吡啉相關(guān)周期性綜合征、痛風(fēng)、Ⅱ型糖尿病、克羅恩病、動(dòng)脈粥樣硬化等[8]。NLRP3炎性體促進(jìn)炎癥的有害作用和活性失調(diào)引起疾病的發(fā)生將是我們研究的重點(diǎn)。

在缺血狀態(tài)下，心肌細(xì)胞氧含量迅速下降，可引起心肌缺血，局部組織細(xì)胞發(fā)生死亡。本研究利用氯化鈷和低氧細(xì)胞培養(yǎng)箱體外培養(yǎng)大鼠的心肌成纖維細(xì)胞，模擬心肌缺氧微環(huán)境，利用實(shí)時(shí)定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NLRP3基因在實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)明顯高于對照組。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，在心肌缺氧狀態(tài)下，NLRP3可能作為重要的信號分子參與了心肌損傷的過程。

綜上所述，當(dāng)心肌細(xì)胞發(fā)生缺氧時(shí)，NLRP3表達(dá)增高，引起一系列的免疫應(yīng)答反應(yīng)，導(dǎo)致心肌細(xì)胞的進(jìn)一步嚴(yán)重?fù)p傷。通過本課題研究，我們初步認(rèn)為，NLRP3可能成為早期診斷心肌缺血缺氧的重要分子靶點(diǎn)，也為心肌缺血后的免疫應(yīng)答機(jī)制提供了一定的分子理論基礎(chǔ)。

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