朱瑞杰 王紅兵

目前胃癌被認(rèn)為是1種多基因遺傳和表觀遺傳的綜合性病變[1]。核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(excision repair cross-complementing gene 1,ERCC1)是1種重要的DNA修復(fù)基因。本研究采用甲基化特異性PCR(MSP)技術(shù)檢測胃癌ERCC1基因甲基化狀態(tài)，以了解胃癌組織、相應(yīng)癌旁組織及正常胃組織中ERCC1基因甲基化水平。

1 材料與方法

1.1 研究對象

收集2012年5月-2012年8月徐州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院普外科手術(shù)切除的新鮮胃癌組織共30例。相應(yīng)的30例癌旁組織作為對照組，另取10例胃部良性病變旁正常胃組織也作為對照組。癌旁組織距離癌組織5 cm以上。30例患者中男性18例，女性12例，年齡37～77歲，中位年齡53歲。所有病例術(shù)前均未接受過放化療，每例均有詳細(xì)的臨床資料和手術(shù)記錄，且均經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)。所有標(biāo)本均于術(shù)后半小時內(nèi)獲得，液氮速凍后-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要試劑和儀器

主要試劑：基因組DNA提取試劑、EZ DNA甲基化試劑盒-Gold、PCR試劑。儀器：PCR儀、紫外分光光度儀。

1.3 方法

1.3.1 組織DNA提取和甲基化修飾 每個樣本取30 mg左右組織塊進(jìn)行勻漿處理，參照組織基因組DNA提取試劑盒說明書提取基因組DNA，UV3000紫外分光光度儀測定DNA濃度和純度，OD260/OD280比值在1.8～2.0之間的DNA用于甲基化修飾。各樣本DNA取800 ng，參照EZ DNA甲基化試劑盒說明書進(jìn)行甲基化修飾，修飾好的DNA洗脫后于-20 ℃保存。

1.3.2 甲基化特異性 PCR (methylation specific PCR,MSP)取修飾好的DNA 2 μl進(jìn)行MSP反應(yīng)。ERCC1基因甲基化引物：M，F(xiàn)：5′-TTTAGGATTATAGAGAGTAGCGCGA-3′，R：5′-CAAAAAAAATAAAAACGATACAACG-3′。非甲基化引物：U，F(xiàn)：5′-TTTAGGATTATAGAGAGTAGTGTGA-3′，R：5′-AAAAAAATAAAAACAATACAACACC-3′。反應(yīng)體系按照PCR試劑盒推薦量25 μl體系進(jìn)行：PCR混合液12.5 μl，上下游引物各0.5 μl，模板2 μl，無核酶水9.5 μl。MSP循環(huán)條件：97 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行40個循環(huán)擴(kuò)增：95 ℃變性40 s，甲基化引物及非甲基化引物分別在57 ℃、55 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，最后于72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。甲基化特異性引物(M)擴(kuò)增的目的片段為166 bp，非甲基化特異性引物(U)擴(kuò)增的目的片段為164 bp。取10 μl PCR產(chǎn)物在2.5%瓊脂糖凝膠上電泳，以TIANGEN 100 bp DNA Ladder (MD101-01)為標(biāo)準(zhǔn)DNA Marker同步電泳，溴化乙啶染色后凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果并記錄。判斷標(biāo)準(zhǔn)[2]：M陽性、U陰性為完全甲基化；M陽性、U陽性為部分甲基化；M陰性、U陽性為非甲基化。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

統(tǒng)計分析應(yīng)用SPSS16.0版統(tǒng)計軟件。甲基化結(jié)果采用χ2檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

30例胃癌組織中ERCC1基因發(fā)生完全甲基化14例，發(fā)生部分甲基化9例，甲基化率為76.7% (23/30)；相應(yīng)的癌旁組織中發(fā)生完全甲基化1例，發(fā)生部分甲基化3例，甲基化率為13.3% (4/30)，兩者差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=12.15，P<0.05)。10例正常胃組織均未出現(xiàn)甲基化條帶，見圖1。

A為胃癌組織的完全甲基化；B為胃癌組織的部分甲基化；C為癌旁組織的完全甲基化；D為癌旁組織的部分甲基化；E為正常胃組織的非甲基化；M為甲基化(166 bp)；U為非甲基化(164 bp)

圖1 ERCC1基因甲基化檢測(MSP)

3 討論

表觀遺傳學(xué)(Epigenetics)是由C.H.Waddington首先提出的。Holiday針對“Epigenetics”作出了更加系統(tǒng)性的論斷，即“DNA序列不發(fā)生改變的情況下，所發(fā)生的可遺傳性基因表達(dá)的改變”[3]，包括DNA甲基化、組蛋白修飾、基因組印記、隔離蛋白以及非編碼RNA調(diào)控等。DNA甲基化是基因表達(dá)的重要表觀遺傳學(xué)形式，在細(xì)胞生長、胚胎發(fā)育、基因表達(dá)調(diào)控、寄生DNA序列的抑制、基因組結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定等方面發(fā)揮著不可缺少的作用，是目前研究最多也最為深入的表觀遺傳學(xué)表達(dá)機(jī)制。

核苷酸切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1(excision repair cross-complementing gene 1,ERCC1)是DNA損傷修復(fù)基因，是核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair,NER)途徑的限速步驟[4]。ERCC1基因定位于人染色體19q13.2，基因全長15 kb，含10個外顯子，編碼由297個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，其分子量為32.5 KD。

目前國內(nèi)外關(guān)于胃癌組織中ERCC1蛋白表達(dá)的研究有報道，其結(jié)果顯示[5]胃癌組織中存在不同程度的ERCC1蛋白表達(dá)低下或缺失。但針對胃癌組織中ERCC1基因甲基化的情況缺乏系統(tǒng)性研究。本研究采用甲基化特異性PCR技術(shù)檢測30例胃癌組織、相應(yīng)癌旁組織及10例正常胃組織中ERCC1基因甲基化狀況，結(jié)果顯示胃癌組織的甲基化率為76.7%，顯著高于癌旁組織中該基因的甲基化率13.3%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。10例正常胃組織均未檢測到甲基化的發(fā)生。

綜上所述，胃癌組織中存在高比例的ERCC1基因甲基化，為下一步研究ERCC1基因甲基化是否具有一定的臨床意義打下了理論基礎(chǔ)。

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