吳龍火 溫慧玲 李加林 郭小華

(贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，江西 贛州 341000)

軟骨細(xì)胞發(fā)生過(guò)度凋亡是骨關(guān)節(jié)炎(OA)發(fā)病機(jī)制之一，但關(guān)于其分子調(diào)控機(jī)制還不是很清楚。九里香為蕓香科植物九里香的干燥葉和帶葉嫩枝，具有行氣止痛、活血散瘀、祛風(fēng)除濕、麻醉鎮(zhèn)驚等功效〔1，2〕?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，九里香具有抗生育和終止妊娠、抗菌、抗甲狀腺腫大、降血糖、麻醉鎮(zhèn)靜及增強(qiáng)免疫功能等作用〔3〕。近年來(lái)有關(guān)九里香的實(shí)驗(yàn)研究較多，但大多集中在化學(xué)成分等研究方面〔4～6〕。中藥發(fā)揮藥效學(xué)活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，可能是中藥提取物中的原型成分，也可能是代謝產(chǎn)物，而只有被吸收入血的化學(xué)成分才可能是真正發(fā)揮藥效的活性物質(zhì)。

本課題組前期研究表明，九里香葉醇提物具有顯著的抗炎鎮(zhèn)痛活性，具有防治OA作用〔7〕。在中國(guó)藥典2010 年版中，只記載有九里香的顯微鑒別和理化鑒別〔8〕。目前，九里香藥材的特征圖譜尚未見(jiàn)報(bào)道，九里香中發(fā)揮抗炎鎮(zhèn)痛活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)研究也較少。因此，本課題利用含藥血清培養(yǎng)OA軟骨細(xì)胞，分析其抗凋亡情況。

1 材料與方法

1.1材料 Agilent1100高效液相色譜儀(DAD檢測(cè)器，美國(guó)Agilent公司)；Sartorius BS214-D(北京賽多利斯系統(tǒng)有限公司)；AE240天平(十萬(wàn)分之一)；XW-80A漩渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；TGL-16G高速離心機(jī)(上海手術(shù)器械廠)。

乙腈為色譜純(TEDIA)；水為娃哈哈純凈水；其他試劑均為分析純?cè)噭?。九里香藥材采自福建漳州，?jīng)贛南醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院李加林老師鑒定為九里香的干燥葉和帶葉嫩枝。Wistar大鼠，雌雄各半，(200±20)g，均由贛州市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(贛)2008-0002。

慈王村山林散養(yǎng)珍珠草雞產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，使得慈王村在經(jīng)濟(jì)發(fā)展的同時(shí)，其生態(tài)環(huán)境的改善，水土流失的防范和保護(hù)作用明顯，貧困村民對(duì)荒地、廢地的管理對(duì)慈王村的農(nóng)田、耕地起到了良好的屏障作用，對(duì)于維護(hù)生態(tài)平衡、改善全村生態(tài)環(huán)境、提高綜合生產(chǎn)能力、促進(jìn)現(xiàn)代農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展起到積極的作用。

TRP通道的發(fā)現(xiàn)為疼痛治療開(kāi)辟了一個(gè)嶄新的領(lǐng)域。與以往的鎮(zhèn)痛藥物不同，以TRP通道為靶點(diǎn)的新型鎮(zhèn)痛藥物能從源頭上消除疼痛的產(chǎn)生。但我們應(yīng)清楚地認(rèn)識(shí)到，TRP通道組織分布廣泛，生理功能多樣，以此為靶點(diǎn)的藥物在發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的同時(shí)往往伴隨著副作用。TRPV1拮抗劑正是因?yàn)榫哂畜w溫過(guò)高的不良反應(yīng)而阻礙了其在臨床上的應(yīng)用。因此，減少此類藥物的不良反應(yīng)將是研發(fā)的難點(diǎn)。進(jìn)一步研究TRP通道在疼痛中的作用對(duì)于闡明疼痛的發(fā)生機(jī)制、治療及相關(guān)藥物研發(fā)具有重要意義。

超寬帶接收機(jī)應(yīng)用到的器件，大部分都是寬帶或者高頻器件，這些射頻器件具有幅頻特性，其中寬帶放大器的增益隨著頻率的增高以6 dB每倍頻程下降[8-10]；無(wú)源器件的插損隨頻率的升高而增加；同型號(hào)的器件套間還存在變化斜率的差異，這些因素疊加起來(lái)會(huì)造成寬帶信道鏈路增益的波動(dòng)可達(dá)10 db以上，嚴(yán)重影響了系統(tǒng)的正常使用。

術(shù)后正常飼養(yǎng)8 w，對(duì)其膝關(guān)節(jié)部分進(jìn)行光學(xué)檢查。利用Ⅱ型膠原酶法配合胰蛋白酶進(jìn)行消化分離，得到正常組及OA組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞后，分別用空白血清及含藥血清進(jìn)行培養(yǎng)，利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行凋亡檢測(cè)。

1.2.1.2含藥血清樣品的制備 稱取九里香浸膏，溶于2%吐溫-80溶液，配制成劑量100 mg/kg給予大鼠灌胃。取Wistar大鼠(20只)，禁食12 h(自由飲水)，按照100 mg/kg劑量(中國(guó)藥典2010版推薦劑量)灌胃7 d，第八天灌胃后1 h，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血5 ml，靜置分離血清，以備培養(yǎng)軟骨細(xì)胞所用。取新鮮含藥血清5 ml，加入乙酸乙酯30 ml萃取3次，合并萃取液，蒸干，甲醇定容至200 μl，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，以備HPLC檢測(cè)。

1.2.1.3空白血清樣品的制備 取Wistar大鼠(20只)，禁食12 h(自由飲水)，按照1.2.1.2項(xiàng)給予等體積的2%吐溫-80溶液灌胃7 d，第8天灌胃后1 h，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血5 ml，靜置分離血清，以備培養(yǎng)軟骨細(xì)胞所用。取新鮮含藥血清5 ml，加入乙酸乙酯30 ml萃取三次，合并萃取液，蒸干，甲醇定容至200 μl，0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，以備HPLC檢測(cè)。

1.2方法

（2）施工必須權(quán)責(zé)分明，使施工人員明確自己的職責(zé)，施工出現(xiàn)滲漏問(wèn)題，往往都是施工不當(dāng)所引起的所以，在施工中如果工程質(zhì)量出現(xiàn)了問(wèn)題，要立刻能夠找出責(zé)任人，對(duì)其進(jìn)行責(zé)任追究，這樣可以最大程度的減少施工質(zhì)量問(wèn)題的出現(xiàn)。

1.2.2大鼠OA模型的建立及OA軟骨細(xì)胞的培養(yǎng) 每組6只大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，參照文獻(xiàn)〔5〕復(fù)制大鼠實(shí)驗(yàn)性O(shè)A模型。常規(guī)消毒，以3%戊巴比妥30 mg/kg腹腔注射麻醉后，仰臥于手術(shù)臺(tái)上，在無(wú)菌條件下在右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)縱行切開(kāi)約2 cm，逐層分離，將臏骨向后向外翻，最大限度屈曲膝關(guān)節(jié)，顯露膝關(guān)節(jié)腔。用顯微器械切斷前交叉韌帶、內(nèi)側(cè)負(fù)韌帶，完整切除內(nèi)側(cè)半月板后，逐層縫合傷口，分籠飼養(yǎng)，允許自由活動(dòng)。術(shù)后給予青霉素10萬(wàn)U肌肉注射抗炎，連續(xù)5 d。

1.2.1.1九里香浸膏樣品的制備 精密稱取九里香(粉碎，過(guò)100目篩)粉末約500 g，放入錐形瓶中，加入75%乙醇5 000 ml，回流提取2 h，濃縮至浸膏85.3 g。取浸膏8.5 g，加甲醇溶解定容至100 ml，過(guò)0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾即得，以備建立指紋圖譜所用。

1.2.1樣品的制備

1.1 研究對(duì)象 收集2013年8月至2016年11月，在濰坊市婦幼保健院行NT、胎兒鼻骨超聲檢查的單胎胎兒資料共6 729例，存在超聲軟指標(biāo)異常者共283例。

2.1九里香含藥血清的抗凋亡試驗(yàn) 成功構(gòu)建大鼠OA模型。利用甲苯胺藍(lán)試劑對(duì)軟骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定(圖1)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，正常組的凋亡率為9.43%，OA模型未治療組的凋亡率為37.15%，九里香含藥血清組的軟骨細(xì)胞凋亡率為15.24%，說(shuō)明九里香含藥血清大大降低了軟骨細(xì)胞的凋亡情況。

展會(huì)同期舉辦了2012中國(guó)水利工程機(jī)械發(fā)展論壇，以“‘十二五’水利基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè)與發(fā)展”為主，以水利機(jī)械行業(yè)工作會(huì)議、中國(guó)工程機(jī)械租賃業(yè)頒獎(jiǎng)慶典、水井鉆探設(shè)備及高效鉆進(jìn)技術(shù)交流論壇三個(gè)專業(yè)性分論壇為輔，解讀“十二五”水利政策，探討水利建設(shè)前沿的技術(shù)與應(yīng)用，對(duì)各省水利項(xiàng)目投資與規(guī)劃、工程融資、設(shè)備租賃、新型科技等方面進(jìn)行深入研討。年度“50強(qiáng)企業(yè)”“十大最具發(fā)展?jié)摿ζ髽I(yè)”“十大風(fēng)云人物”“十大最具競(jìng)爭(zhēng)力租賃品牌”的評(píng)選活動(dòng)也在展會(huì)期間揭曉。

1.2.4人血成分的初步研究 進(jìn)一步從原藥材中制備分離純化及進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，通過(guò)紅外、紫外、質(zhì)譜和1HNMR和13CNMR進(jìn)行表證。通過(guò)與血清學(xué)HPLC進(jìn)行相對(duì)保留時(shí)間的比較。

2 結(jié) 果

1.2.3色譜條件 色譜柱為迪馬AgilentC18(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為乙腈和水梯度洗脫系統(tǒng)；檢測(cè)波長(zhǎng)為337 nm；柱溫為25 ℃；流速為1.0 ml/min；進(jìn)樣量為20 μl?？疾觳煌荻认律V峰的分離度以及峰的數(shù)目。最后確定梯度洗脫程序?yàn)?0～5 min, 5%乙腈; 5～7 min, 18%乙腈;7～12 min, 18%乙腈; 12～22 min, 24%乙腈；22～30 min, 24%乙腈； 30～35 min, 35%乙腈；35～45 min, 35%乙腈；45～50 min, 50%乙腈；50～60 min，50%乙腈；60～80 min，100%乙腈。

2.2各供試樣品的HPLC指紋圖譜的建立 圖2可見(jiàn)，通過(guò)對(duì)HPLC色譜峰的對(duì)比，發(fā)現(xiàn)九里香含藥血清中有效成分達(dá)16種或以上，其中大多數(shù)為代謝成分；色譜峰1、3、4、7、9、11與九里香供試液HPLC對(duì)照?qǐng)D譜對(duì)應(yīng)，為原型成分，色譜峰2、5、6、8、10、12、13、14、15、16在對(duì)照?qǐng)D譜中未出現(xiàn)，推測(cè)可能均為代謝產(chǎn)物。

圖1 軟骨細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞圖

圖2 各供試樣品的HPLC指紋圖譜

2.3主要成分的結(jié)構(gòu)鑒定 分離得到的化合物A：白色粉末(乙醇-水)，mp：195℃～197℃，C19H18O6，紫外線下顯亮黃色熒光，鹽酸鎂粉反應(yīng)陽(yáng)性，顯淡紫紅色。UV λmax(nm)：212，337。IR ν (cm-1)：3 401，1 647，1 605，1 516。EI-MS m/z：343〔M〕+。1H NMR(500 M Hz，CDCl3)：δ7.49(1H，dd，J=9.0，1. 8Hz，6’-H)，7.26(1H，d，J=1.8 Hz，2’-H)，6.92(1H，d，J=9.0 Hz，5’-H)，6.54(1H，s，3-H)，6.56(1H，d，J=2.4 Hz，8-H)，6.34(1H，d，J=2.4 Hz，6-H)，3.96(6H，brs，3’-OMe)，3.95(3H，s，4’-OMe)，3.94(3H，s，5-OMe)，3.90(3H，s，7-OMe)。13C NMR(100 mHz，CDCl3)：δ177.3(C-4)，164.8(C-7)，161.2(C-2)，160.8(C-5)，159.9(C-9)，152.4(C-4’)，148.6(C-3’)，125.2(C-1’)，119.7(C-6’)，112.1(C-5’)，110.3(C-10)，108.9(C-2’)，106.7(C-3)，97.3(C-6)，93.4(C-8)，57.1(OMe-4’)，56.8(OMe -5)，55.9(OMe -3’)，55.2(OMe -7)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)分析，與文獻(xiàn)〔9〕基本一致，故確定該化合物為九里香酮。分離得到的化合物B：白色粉末(乙醇-水)，mp：118℃～120℃，C15H14O4。異羥肟酸鐵反應(yīng)陽(yáng)性，紫外燈(365 nm)下呈藍(lán)色熒光。UV λmax(nm)：246，258，322。IR ν (cm-1)：2 964，1 713，1 608，1 498。EI-MS m/z：258 〔M〕+。1H NMR(500 mHz，CDCl3)：δ7.63(1H，d，J=10 Hz，4-H)，7.42(1H，d，J=8.5 Hz，5-H)，6.89(1H，d，J=8.7 Hz，6-H)，6.26(1H，d，J=10 Hz，3-H)，5.2(1H，s，4’ -H)，5.08(1H，s，4’ -H)，3.99(1H，d，J=2.0 Hz，1’-H)，3.97(3H，s，OMe)，3.92(1H，d，J=2.0 Hz，2’-H)，1.87(3H，s，5’-CH3)。13C NMR(100 mHz，CDCl3)：δ162.2(C-2)，160.6(C-7)，154.1(C-10)，143.6(C-3’)，141.6(C-4)，129.2(C-5)，113.7(C-8)，113.1(C-3)，112.8(C-9)，107.9(C-4’)， 60.9(C-2’)，56.6(C-6’)，52.1(C-1’)，17.7(C-5’)。結(jié)合以上數(shù)據(jù)分析，與文獻(xiàn)〔10〕基本一致，故確定該化合物為脫水長(zhǎng)葉九里香內(nèi)酯(Phebalosin)。

九里香葉中分離得到的主要成分九里香酮和phebalosin的HPLC色譜圖分別對(duì)應(yīng)九里香供試液HPLC對(duì)照?qǐng)D譜中的色譜峰9和11，其保留時(shí)間分別為40.277 min和47.585 min。見(jiàn)圖2。

3 討 論

本課題組的前期研究結(jié)果表明〔7〕，以75%乙醇回流提取2 h的方法最佳。對(duì)不同流動(dòng)相系統(tǒng)及不同檢測(cè)波長(zhǎng)的考察結(jié)果表明，本試驗(yàn)在337 nm的檢測(cè)波長(zhǎng)下，以乙腈-水系統(tǒng)梯度洗脫，樣品的大部分色譜峰基本分離。同時(shí)，對(duì)各供試液的穩(wěn)定性、儀器的精密度和測(cè)定方法的重復(fù)性進(jìn)行了考察，均符合相關(guān)要求。

中藥血清藥物化學(xué)這種方法是建立在“只有入血成分才可能是藥效成分”的假說(shuō)基礎(chǔ)之上的〔11〕，主要是通過(guò)分析給藥后存在于血清中的成分，確定中藥在動(dòng)物體內(nèi)的直接作用物質(zhì)基礎(chǔ)；但它們也存在一些局限性〔12〕，如很難確定血清中檢測(cè)到的所謂“成分”是非活性成分還是活性成分的代謝產(chǎn)物，這些為分離帶來(lái)困難，也為空間結(jié)構(gòu)鑒定帶來(lái)困難。小分子化合物在血清中的存在方式可能是游離的，也可能是與轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合。在處理血清樣品時(shí)，考慮到處理方法對(duì)色譜峰的干擾影響〔13〕，本試驗(yàn)采用直接加入乙酸乙酯進(jìn)行多次萃取，合并有機(jī)相，干燥、蒸干、甲醇定容，以便獲得更多的信息。

九里香葉中的主要有效成分為黃酮類和香豆素類化合物。這兩大類化學(xué)結(jié)構(gòu)上的酚羥基大部分被醚化，總體極性屬于適中范圍〔14〕，大部分化合物的保留時(shí)間在20～ 60 min。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)九里香血清藥物化學(xué)對(duì)OA軟骨細(xì)胞有明顯的抗凋亡作用。為進(jìn)一步研究血清藥物化學(xué)的成分，我們利用HPLC進(jìn)行中藥圖譜和血清圖譜的比對(duì)，分析血清中可能的化學(xué)成分變化。利用硅膠柱層析及半制備HPLC進(jìn)行跟蹤導(dǎo)向分離得到兩個(gè)化合物，其相對(duì)保留時(shí)間與圖譜中色譜峰9和11基本一致。但色譜峰9和11與中藥中分離得到的化合物的相對(duì)保留時(shí)間一致并不能直接說(shuō)明就是同一個(gè)化合物，需要進(jìn)一步借用其他相關(guān)手段(如LC-MS等)進(jìn)行鑒定。另外，對(duì)于其中特征峰的研究也有待進(jìn)一步系統(tǒng)化，從整體上把握中藥內(nèi)“有效組分群”協(xié)同作用的特性〔15〕。

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