李 鑫 張曉蕓 金成文 成 敏

(濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 濰坊 261053)

吲哚美辛已廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療〔1〕，但其機(jī)制目前尚不清楚。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為損傷周邊的內(nèi)皮細(xì)胞可通過遷移、增殖修復(fù)內(nèi)皮缺損。但成熟內(nèi)皮細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，其增殖潛能有限，修復(fù)能力并不理想〔2〕。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs) 是成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，正常情況下在外周循環(huán)血中的數(shù)量較少。受各種因素的刺激動(dòng)員后(如血管內(nèi)皮受損后)，外周血中EPCs的數(shù)量迅速增加，進(jìn)而EPCs向血管內(nèi)皮細(xì)胞分化，在內(nèi)皮損傷后的修復(fù)過程中起到重要作用〔3，4〕。本研究著重觀察吲哚美辛對損傷頸動(dòng)脈再內(nèi)皮化的作用，并從EPCs的角度探討其作用機(jī)制。

1 材料方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年雄性SD大鼠，體重250 g左右，由濰坊市解放軍第八十九醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2主要試劑與藥品 Histopaque-1083梯度離心液及伊文氏藍(lán)(Evens blue)(美國Sigma公司)；EGM-2(美國Lonza公司)；吲哚美辛鈉(上海源葉生物科技有限公司)；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基苯四氮唑藍(lán)(MTT)(北京中杉)；纖維連接蛋白(Fn)及DAPI(德國Roche)；Matrigel 基質(zhì)膠(美國BD公司)；改良的Boyden小室及8 μm聚碳酸醋微孔濾膜(江蘇海門麒麟醫(yī)用儀器廠)；Forgety導(dǎo)管(Edwards Lifesciences，Unterschleissheim，Germany)。吲哚美辛鈉的配制：體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：使用生理鹽水配制成5 mg/ml的儲(chǔ)存液，過濾后儲(chǔ)存于4℃冰箱內(nèi)備用。體外實(shí)驗(yàn)：使用EGM-2培養(yǎng)液配制成5 mg/ml的儲(chǔ)存液，過濾后儲(chǔ)存于4℃冰箱內(nèi)備用。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物模型制備及分組 健康SD大鼠隨機(jī)分為模型組及吲哚美辛處理組。采用球囊法制備大鼠頸動(dòng)脈損傷模型：10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔注射麻醉，分離左側(cè)頸總動(dòng)脈。從頸外動(dòng)脈遠(yuǎn)心端切口將2F Forgety導(dǎo)管插入，充分充盈球囊，向左右各轉(zhuǎn)動(dòng)3次，損傷局部頸總動(dòng)脈。手術(shù)結(jié)束后，吲哚美辛處理組腹腔注射吲哚美辛(10 mg/kg)，每2 d一次，連續(xù)2 w；模型組注射等劑量無菌生理鹽水。2 w后處死大鼠，分離頸總動(dòng)脈，取材。

血管內(nèi)膜修復(fù)的評(píng)價(jià)：通過對伊文氏藍(lán)染色區(qū)域的測量，評(píng)價(jià)損傷血管內(nèi)皮的再內(nèi)皮化，即血管內(nèi)皮的修復(fù)程度。實(shí)驗(yàn)大鼠處死前30 min，尾靜脈注射0.5%伊文氏藍(lán)(20 mg/kg)。過量麻醉并處死大鼠，取損傷側(cè)頸總動(dòng)脈，拍照。伊文氏藍(lán)染區(qū)域?yàn)閮?nèi)皮剝脫區(qū)。血管內(nèi)皮的再內(nèi)皮率=(1-染色區(qū)域的面積/血管總的區(qū)域面積)×100%。

1.3.2EPCs 分離、培養(yǎng) 參照本課題組前期方法進(jìn)行〔5〕。頸椎脫臼法處死大鼠，無菌取出大鼠四肢長骨，PBS反復(fù)沖洗骨髓腔至無色。將骨髓細(xì)胞懸液1 000 r/min 離心5 min，棄上清，PBS 清洗2次后3 ml PBS 重懸，以1∶1比例小心加到梯度離心液表面，700 r/min 離心30 min，吸取中間白色細(xì)胞層，加PBS洗滌2次，棄上清，用EGM-2培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將其接種于預(yù)先包被有Fn的培養(yǎng)瓶中，含5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5 d后更換培養(yǎng)液，以后每隔3 d更換一次培養(yǎng)液。傳至第三代EPCs(晚期EPCs) 時(shí)，細(xì)胞可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3增殖能力檢測 體外誘導(dǎo)培養(yǎng)的晚期EPCs，待鋪滿瓶底90%左右，胰酶消化，按照1.5×104/ml的密度均勻種植于96孔板內(nèi)，每孔100 μl。24 h后待細(xì)胞貼壁，用0.625、0.312 5、0.1562 5 mg/ml(分別相當(dāng)于大鼠體內(nèi)注射濃度的1/8，1/16及1/32)的吲哚美辛處理EPCs24 h。藥物處理完成后，小心棄去上清，每孔加入10 μl MTT溶液+含2%小牛血清的M199培養(yǎng)液，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。小心棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μl二甲基亞砜，搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解。使用酶聯(lián)免疫檢測儀OD 490 nm處測量各孔的吸光度值。

1.3.4黏附能力檢測 晚期EPCs，胰酶消化后，按照2×104/ml的密度，均勻種于六孔板內(nèi)，每孔2 ml。待細(xì)胞鋪滿瓶底大約60%～70%時(shí)，用不同濃度的吲哚美辛處理EPCs24 h。胰酶再次消化收集細(xì)胞，離心后計(jì)數(shù)，分別以2×104/ml的密度接種于事先Fn包被的24孔板中，每孔1 ml，30 min后棄上清，PBS清洗3次，顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)，每組3復(fù)孔，每孔5個(gè)視野。

1.3.5遷移能力檢測 EPCs藥物處理后，胰酶消化收集單個(gè)細(xì)胞，離心后用含有2%胎牛血清的培養(yǎng)液重懸并計(jì)數(shù)，以2×104/ml的密度接種于Boyden小室的上室，每孔200 μl，下室為與上室相同的培養(yǎng)液，小室中間為8 μm聚碳酸醋微孔濾膜。置于含有5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中。12 h后，取出中間濾膜，棉簽涂抹掉上層未遷移的細(xì)胞，PBS清洗3次后，DAPI染色，顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)。

1.3.6成血管能力檢測 藥物處理后的EPCs，胰酶消化離心收集單個(gè)細(xì)胞，EGM-2培養(yǎng)基重懸后計(jì)數(shù)，以2×105/ml的密度接種于事先包被有Matrigel基質(zhì)膠(100 μl/孔)的96孔板內(nèi)，每孔100 μl細(xì)胞懸液，10 h后，顯微鏡下觀察并拍照。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0軟件，組間比較行t檢驗(yàn)或ANOUA分析。

2 結(jié) 果

2.1吲哚美辛對體內(nèi)頸動(dòng)脈損傷模型血管修復(fù)能力的影響 吲哚美辛加速了大鼠受損頸總動(dòng)脈內(nèi)皮的修復(fù)。在第2周，吲哚美辛處理組大鼠頸總動(dòng)脈受損區(qū)域再內(nèi)皮化率明顯高于模型組大鼠(P<0.01)。見圖1。

2.2吲哚美辛對晚期EPCs增殖能力的影響 與對照組相比，吲哚美辛處理24 h后，0.625 mg/ml濃度組EPCs增殖能力明顯增強(qiáng)(P<0.01)，0.312 5 mg/ml 濃度組EPCs增殖能力也有所增加(P<0.05)。

2.3吲哚美辛對晚期EPCs粘附能力的影響 不同濃度吲哚美辛分別處理EPCs 24 h后，與對照組相比各濃度組EPCs粘附能力均明顯增強(qiáng)(P<0.01)。

2.4吲哚美辛對晚期EPCs遷移能力的影響 與對照組相比，吲哚美辛處理24 h后，0.312 5 mg/ml濃度組EPCs遷移能力增加(P<0.05)。

2.5吲哚美辛對晚期EPCs成血管能力的影響 與對照組相比，吲哚美辛處理后各濃度組成血管能力明顯增強(qiáng)，形成血管腔數(shù)目明顯增加(P<0.01)，細(xì)胞之間形成的連接更加緊密、長側(cè)支明顯。見圖2。

圖1 吲哚美辛對受損血管內(nèi)皮修復(fù)的影響

圖2 吲哚美辛對EPCs成血管能力的影響

3 討 論

吲哚美辛為非甾體類抗炎藥，可選擇性抑制環(huán)氧化酶而減輕前列腺素的合成，抑制炎癥反應(yīng)。有研究發(fā)現(xiàn)，吲哚美辛可通過抑制局部的炎癥反應(yīng)對腦缺血再灌注損傷模型起到保護(hù)作用，具有與自由基清除劑相同的效果〔6，7〕。

本文動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，吲哚美辛能夠明顯增加受損血管的再內(nèi)皮化率。EPCs是血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，存在于骨髓、循環(huán)血液及臍帶血等組織中，正常情況下在外周循環(huán)血中的數(shù)量較少。在某些生理或病理?xiàng)l件下，骨髓中的EPCs可從骨髓動(dòng)員至外周血，外周血中EPCs 的數(shù)量迅速增加，歸巢到血管損傷部位，增殖分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞，通過補(bǔ)充代替凋亡、缺失的內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)受損內(nèi)皮的修復(fù)。因此有人認(rèn)為，外周循環(huán)中EPCs的功能與數(shù)量決定著損傷血管的內(nèi)皮修復(fù)程度。

本研究發(fā)現(xiàn)，處理EPCs 24 h后，三種不同濃度的吲哚美辛均能夠促進(jìn)EPCs的增殖、遷移、黏附及成血管功能，其中以0.625 mg/ml、0.312 5 mg/ml濃度作用最強(qiáng)。文獻(xiàn)報(bào)道，大鼠血容量占體重7%左右〔8〕，動(dòng)物體外實(shí)驗(yàn)中，大鼠血液中瞬時(shí)血藥濃度最高約為注射濃度的7%，此濃度介于本次體外實(shí)驗(yàn)中使用濃度0.625～0.312 5 mg/ml區(qū)間范圍。據(jù)此我們推測，一定濃度范圍內(nèi)的吲哚美辛，在短時(shí)間內(nèi)能夠促進(jìn)EPCs增殖、黏附、遷移及成血管功能，這可能是頸動(dòng)脈損傷模型中吲哚美辛促進(jìn)受損血管修復(fù)的原因之一，詳細(xì)的機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

4 參考文獻(xiàn)

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